無細胞蛋白表達系統(tǒng)研究進展

洪勵上　蘇志寧

摘要:隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，無細胞表達系統(tǒng)備受人們重視。到目前為止，來自原核和真核生物的無細胞表達系統(tǒng)已達十幾種。本文就無細胞蛋白表達系統(tǒng)的現(xiàn)狀、應(yīng)用及所面臨的問題作一綜述。

關(guān)鍵詞:無細胞系統(tǒng)；蛋白表達;蛋白質(zhì)組學(xué)

1引言

近年來，無細胞蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)再次受到關(guān)注。相比較體內(nèi)表達，無細胞蛋白表達系統(tǒng)具有其明顯的優(yōu)點[]，例如，不受細胞生理限制可進行較大量的毒性蛋白表達；產(chǎn)物的活性和溶解性增加；產(chǎn)物不受胞內(nèi)蛋白酶的降解；反應(yīng)可以在短時間內(nèi)進行；無需繁雜的下游處理；適合于高通量表達。而且通過優(yōu)化反應(yīng)系統(tǒng)，可以得到高產(chǎn)率表達產(chǎn)物。總之，在無細胞系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)可提高目標蛋白的表達效果。

隨著核酸測序技術(shù)、芯片技術(shù)和RNA干擾技術(shù)的建立和突破，人們對核酸信息的了解越來越多。而生命過程最終多是以蛋白質(zhì)形式執(zhí)行其功能的，因此對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究成為后基因組時代重要的工作。因此，發(fā)展能夠合成任何目標蛋白系統(tǒng)以及實現(xiàn)高通量表達是當今生物技術(shù)中重要的課題。

2無細胞蛋白表達系統(tǒng)

無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)是一種以外源DNA或mRNA為模板，利用細胞抽提物中的蛋白合成機器、蛋白折疊因子及其他相關(guān)酶系，通過添加氨基酸、T7聚合酶和能量物質(zhì)等來實現(xiàn)蛋白質(zhì)表達的體外系統(tǒng)（如圖一），1958年，Zamecnik首次證明，從細胞抽提物中獲得的翻譯機器可以介導(dǎo)體外的蛋白的合成；1961年，Nirenberg和Matthaei[4]利用蛋白質(zhì)的無細胞合成體系，以破譯遺傳密碼子。該方法對蛋白翻譯機制的研究，同樣也作出了重要貢獻。然而，當時由于此方法的表達量有限，無法進行規(guī)?；a(chǎn)，因此，在過去幾十年一直沒能被重視起來。

隨著人們對蛋白質(zhì)生物合成機制的深入了解，建立穩(wěn)定的無細胞蛋白表達體系已成為可能?，F(xiàn)已確定，蛋白質(zhì)生物合成的機器是核糖體，如果存在有tRNA，以及蛋白折疊加工必需的酶和各種相關(guān)因子，只要提供外源的RNA模板、氨基酸和能量，無需其他的細胞結(jié)構(gòu)（如線粒體），蛋白質(zhì)合成也能順利進行。 而在各種細胞的裂解液中幾乎都含有蛋白質(zhì)生物合成所需的核糖體以及各種酶和因子。因此，可以在無細胞體系中實現(xiàn)蛋白質(zhì)表達，通過對無細胞反應(yīng)體系的優(yōu)化，系統(tǒng)的穩(wěn)定性和蛋白產(chǎn)率得到了大幅度的提高。

目前，已開發(fā)出來的無細胞表達系統(tǒng)有原核和真核系統(tǒng)兩大類型。原核系統(tǒng)通常是通過E.coli BL21 (DE3)或其他敲除了內(nèi)源蛋白酶和核酸水解酶的菌種，如A19來進行無細胞表達體系的建立；真核系統(tǒng)，目前較為成熟的是利用兔網(wǎng)織紅細胞和麥芽提取物來實現(xiàn)無細胞蛋白表達系統(tǒng)的建立。理論上來說，任何遺傳信息都可以在這兩大類體外表達體系中進行翻譯而得到目的蛋白，但不同的系統(tǒng)有著不同的特點，應(yīng)該根據(jù)自己的需求來進行選擇。

2.1原核系統(tǒng)

原核系統(tǒng)表達系統(tǒng)主要利用大腸桿菌的提取物來實現(xiàn)的。目前對大腸桿菌蛋白合成機制已有十分詳細的認識，這使得大腸桿菌的體外表達系統(tǒng)也隨之不斷得到改進。大腸桿菌提取物基礎(chǔ)上建立的無細胞蛋白表達系統(tǒng)有一個很大的優(yōu)勢就是它的耐受性，它可以在含有其它不同成份雜質(zhì)時仍可以進行目標蛋白的表達。因此人們可以根據(jù)需要加入特殊添加劑如蛋白酶抑制劑， 分子伴侶，代謝物，非天然氨基酸甚至是少量的變性劑，也可摻入特殊標記的氨基酸獲得帶標記蛋白質(zhì)。為此，該體系的彈性非常大，可以加入許多其它必要成份以提高產(chǎn)率和提高溶解性。例如：微修飾過的反應(yīng)環(huán)境可以變成氧化環(huán)境以幫助蛋白形成正確的二硫鍵，然后正確的折疊。加入酶和底物可以完成特定的修飾，比如在絲氨酸和蘇氨酸殘基上進行特定磷酸化修飾。 但是，蛋白的翻譯后加工和如何正確折疊仍然是一個問題，特別是利用這一系統(tǒng)合成那些多結(jié)構(gòu)域構(gòu)成和含有二硫鍵的真核蛋白。不過，由于真核體外合成體系也未能解決蛋白質(zhì)翻譯后加工的問題，而大腸桿菌的材料來源成本最低，實用性高，表達效率也高，因而依舊是體外表達的熱門選擇。

2.2真核系統(tǒng)

2.2.1兔網(wǎng)織紅細胞

兔網(wǎng)織紅細胞是應(yīng)用得較早的一個體外表達系統(tǒng)。網(wǎng)織紅細胞由紅細胞分化而來，在體內(nèi)主要是負責(zé)合成大量血紅蛋白（90%以上），以及球蛋白。這種未成熟的紅細胞本身不帶細胞核，但卻保留了這種高效翻譯各種核酸信息的能力，而沒有復(fù)雜的背景，即使在較低的豐度下也能比較高效地合成產(chǎn)物。根據(jù)測定，體外合成外源蛋白的效率接近完整網(wǎng)織紅細胞自身合成內(nèi)源蛋白的效率。此外網(wǎng)織紅細胞體系內(nèi)源的核酸酶很少，有助于長鏈RNA的穩(wěn)定（包括有帽子或者沒帽子結(jié)構(gòu)的 RNA），因而可以合成較大的蛋白。

2.2.1麥芽提取物

麥芽提取物是不同于網(wǎng)織紅細胞裂解物的另一個無細胞體外合成體系。由于內(nèi)源的mRNA很少，這個系統(tǒng)可用于各種病毒、酵母、高等植物乃至哺乳動物蛋白的合成。 這個體系要求RNA有帽子結(jié)構(gòu)才能更好的翻譯。此系統(tǒng)廣泛用于放射標記多肽和蛋白的合成。合成量不太高，直到最近[5]才通過延長合成時間的方式提高了產(chǎn)率。如果要保持麥芽提取物系統(tǒng)持續(xù)數(shù)日的合成效率，就必需保證反應(yīng)體系不含有任何會破壞核糖體功能以及其它合成中使用到的相關(guān)的酶。這樣此系統(tǒng)的合成效率可以被不斷加強，由試驗結(jié)果顯示，24小時內(nèi)最高的合成量可達1mg/ml。麥芽提取物系統(tǒng)和大腸桿菌系統(tǒng)都適合進行高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

3應(yīng)用

利用無細胞體系表達蛋白質(zhì)已經(jīng)應(yīng)用于很多方面，但是大致可以歸屬于以下兩個方面。

3.1結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用

首先，利用無細胞體系可以進行蛋白質(zhì)的高通量表達，能同時得到許多用于結(jié)晶的蛋白質(zhì)，進而開展結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組的研究。第二，特別是膜蛋白和有細胞毒性的蛋白質(zhì)都可以利用無細胞體系進行表達。第三，可以在蛋白質(zhì)中人為地引入硒代半胱氨酸，有利于蛋白質(zhì)的X射線結(jié)晶學(xué)研究。第四，因為可以在很小體積內(nèi)進行無細胞體系的蛋白質(zhì)表達，這樣有利于蛋白質(zhì)的同位素標記，例如進行了雙重同位素標記蛋白質(zhì)后，無需煩雜的純化，即可進行靈敏的NMR測定。

3.2功能蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用

同樣是由于無細胞體系可以進行蛋白質(zhì)高通量、微量化的表達，表達后又可省去煩雜的分離純化，因此對表達產(chǎn)物的活性測定非常容易，尤其是對酶的活性研究。如果進一步降低無細胞表達體系的體積，使得反應(yīng)濃集在很小區(qū)域內(nèi)（例如在96孔板中），幾乎可以達到蛋白質(zhì)（微）陣列的目的。

在無細胞體系表達蛋白質(zhì)時可以引入非天然氨基酸（其中包括熒光和生物素光標記的氨基酸、可以進行光化反應(yīng)的修飾氨基酸），對蛋白質(zhì)進行修飾和標記。這樣可以更為有效地研究蛋白質(zhì)組中得到的各個組分的功能。

4討論及展望

體外表達由于是在無細胞的條件下進行的，缺少蛋白質(zhì)翻譯后加工所需要的細胞器和空間結(jié)構(gòu)，所以其致命的弱點就是：即使是真核體外表達系統(tǒng)，目前依然無法對蛋白進行糖基化和其它天然蛋白必需的高級修飾。所以有必要對體系進行改進，如滲入單糖基化的氨基酸或加入微粒體（microsome）等，理論上可以實現(xiàn)一些必要的修飾。

基于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究需要進行高通量的蛋白質(zhì)表達，體積無需很大，表達量不必很多，但是要快的速度，表達的蛋白質(zhì)可以被翻譯后加工。而這幾個方面正好是無細胞蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)的專長。為了能使蛋白質(zhì)的無細胞表達更有成效，在方法和技術(shù)上也需改進和發(fā)展。在方法改善的同時，其應(yīng)用也日益拓展。