鎘誘導(dǎo)錦鯉腎臟氧化性DNA損傷及谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)改變

劉思思++高旋旋++胡竹青++程超++渠漫漫++孫晴++劉纏民+++鄭桂紅

摘要：研究鎘（Cd）暴露對(duì)錦鯉（Carassius auratus L.）腎臟氧化應(yīng)激、氧化性DNA損傷、谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的影響。試驗(yàn)采用靜水生物養(yǎng)殖法，將40尾錦鯉隨機(jī)分為4組，每組10尾，分別暴露于0、5、10、20 mg/L的CdCl2水溶液中，持續(xù)96 h。觀察錦鯉的行為變化，測(cè)定腎臟丙二醛（MDA）含量、氧化性DNA指標(biāo)8-羥基鳥嘌呤（8-OHdG）水平、還原型谷胱甘肽（GSH）水平，并檢測(cè)谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷氨酸半胱氨酸連接酶（GCL）的活性。結(jié)果表明，Cd暴露使錦鯉發(fā)生明顯改變，MDA、8-OHdG、GSH水平均升高，并改變了谷胱甘肽抗氧化酶系統(tǒng)。

關(guān)鍵詞：錦鯉；鎘；腎臟；DNA損傷；氧化應(yīng)激

中圖分類號(hào)： S941.91文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0272-02

收稿日期：2015-06-08

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金（編號(hào)：BK20141147）；江蘇省徐州市科技計(jì)劃（編號(hào)：XF11C051）；江蘇省化學(xué)生物學(xué)優(yōu)勢(shì)學(xué)科基金（編號(hào)：PAPD）。

作者簡(jiǎn)介：劉思思（1988—），女，江蘇徐州人，碩士研究生，主要從事生態(tài)學(xué)研究。E-mail：liusisi644@163.com。鎘（Cd）是一種毒性很大的重金屬，主要作為鋅礦、硫化物礦、鉛礦、銅礦等的副產(chǎn)物，在礦的開采、冶煉、精煉過程中進(jìn)入環(huán)境，并對(duì)環(huán)境造成危害。鎘一旦進(jìn)入水中，會(huì)對(duì)水體生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重污染，危害水生生物的生命[1-2]。

錦鯉（Carassius auratus L.）是鯉科（Cyprinidae）鯉屬（Carassius）的一種觀賞魚，顏色艷麗，形態(tài)優(yōu)美，同時(shí)也是水生環(huán)境監(jiān)測(cè)的一種試驗(yàn)魚種類[3]。氧化應(yīng)激是重金屬對(duì)魚類造成損傷的常見方式，很多重金屬都會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷[2-3]。谷胱甘肽抗氧化酶系統(tǒng)由還原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷氨酸半胱氨酸連接酶（GCL）組成，在動(dòng)物機(jī)體抗氧化損傷中承擔(dān)重要作用[4]。研究表明，鎘能夠引起淡水鲇魚（Channa punctatus）[2]、廣東魴（Megalobrama terminalis）[5]、草魚（Ctenopharyngodon idellus）[6]等魚的氧化損傷。本研究以錦鯉為試驗(yàn)對(duì)象，探討鎘暴露對(duì)錦鯉腎臟DNA損傷、谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的影響，以期為環(huán)境監(jiān)測(cè)及鎘害防治提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試紅白錦鯉購自徐州市佳順錦鯉養(yǎng)殖基地，體長5～7 cm、質(zhì)量4～7 g/尾。試驗(yàn)采用靜水生物養(yǎng)殖法。試驗(yàn)用水為曝氣3 d的自來水，每組20 L，24 h不間斷充氧，溶氧量 6 mg/L，pH值6.8，水溫（23±1） ℃。先將錦鯉置于室內(nèi)水族箱進(jìn)行為期7 d的預(yù)試驗(yàn)。錦鯉暫養(yǎng)期間活動(dòng)正常、無病，死亡率低于5%。于試驗(yàn)前24 h停止飼喂，選擇品相較好、健康的紅錦鯉40尾，隨機(jī)分為4組，3個(gè)處理組的CdCl2濃度分別為5、10、20 mg/L。試驗(yàn)期間不飼喂、 不換水，每天觀察其行為。于96 h后處死，取其腎臟，冰浴生理鹽水勻漿，以 3 000 r/min 冷凍離心10 min制備組織上清液，測(cè)定其生化指標(biāo)。

1.2 魚行為觀察

按照Sveceviius的方法[7]將魚的行為活性分為5級(jí)（0、1、2、3、4級(jí)）。每天觀察記錄魚的行為并對(duì)其分級(jí)。

1.3氧化應(yīng)激及谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)測(cè)定

丙二醛（MDA）水平、還原型谷胱甘肽（GSH）水平、蛋白含量、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性、谷胱甘肽還原酶（GR）活性均采用試劑盒（南京市建成生物工程研究所）進(jìn)行測(cè)定，谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）采用蘇州市科名生化指標(biāo)試劑盒測(cè)定，所用儀器為UV-722型紫外可見分光光度計(jì)。

1.4DNA損傷測(cè)定

根據(jù)已有研究的方法[8]，采用商品試劑盒（Wako Pure Chemical Industries，Ltd.），按說明書進(jìn)行操作。采用帶有檢測(cè)器的高效液相色譜（Agilent Technologies，USA）進(jìn)行測(cè)定，8-OHdG 的表示方法為8-OHdG/10-5 deoxyguanosine。

2 結(jié)果與分析

2.1鎘對(duì)魚行為的影響

觀察魚的行為并測(cè)定其行為活性。由圖1可知，不同濃度鎘暴露對(duì)魚的行為具有不同影響。與對(duì)照組相比，中低濃度鎘暴露抑制魚的行為活性，而高濃度鎘暴露則呈1 d時(shí)抑制、之后強(qiáng)烈激發(fā)的現(xiàn)象。以不同時(shí)間比較，各處理組均呈 1 d 行為活性不高、2～3 d活性增強(qiáng)、4 d活性下降的趨勢(shì)，但仍高于對(duì)照組。

2.2鎘對(duì)魚腎臟的氧化應(yīng)激及DNA損傷

MDA含量、8-OHdG水平常作為氧化應(yīng)激的指標(biāo)，由測(cè)定結(jié)果（表1）可知，鎘暴露導(dǎo)致錦鯉腎臟MDA含量、8-OHdG水平明顯升高。與對(duì)照組相比，5、10、20 mg/L鎘暴露下MDA含量分別增大15.2%、169.4%、398.0%，8-OHdG水平分別增大16.1%、32.3%、64.5%?？梢?，鎘暴露引起了錦鯉腎臟氧化應(yīng)激損傷及DNA損傷。

2.3鎘對(duì)錦鯉腎臟谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的影響

由錦鯉腎臟谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果（表2）可知，96 h鎘暴露使系統(tǒng)活性明顯升高。與對(duì)照組相比，5、10、20 mg/L鎘暴露下GSH含量分別增加8.7%、20.2%、27.0%，GPX活性分別提高10.4%、15.7%、24.2%，GST活性分別提高16.3%、33.1%、57.8%，GR活性分別提高 16.0%、30.3%、46.3%，GCL活性分別提高18.1%、28.2%、32.7%。可見，鎘暴露導(dǎo)致錦鯉腎臟谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)發(fā)生改變。

3結(jié)論與討論

鎘會(huì)對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)造成很大影響。本研究表明，不同體積分?jǐn)?shù)的鎘暴露對(duì)錦鯉行為活性具有不同影響，呈低抑制、高激發(fā)的現(xiàn)象。在5、10 mg/L的鎘暴露濃度下，行為活性均明顯低于對(duì)照；20 mg/L的鎘暴露濃度則明顯激發(fā)行為活性，表明高濃度鎘暴露對(duì)錦鯉具有明顯刺激作用。行為活性隨時(shí)間的推移呈早期激發(fā)、后期抑制的趨勢(shì)，表明錦鯉剛接觸鎘刺激時(shí)活性變強(qiáng)，疲憊后活動(dòng)行為變慢。

脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物指機(jī)體中脂質(zhì)被氧化后的產(chǎn)物，是反映氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)。研究表明，鎘能夠強(qiáng)烈抑制線粒體電子傳遞鏈，導(dǎo)致電子無法正常傳遞至接受體，而是傳遞至氧原子，從而產(chǎn)生大量氧自由基，引起機(jī)體氧化損傷[2-9]。氧自由基也可通過多種途徑造成DNA損傷，如引起單鏈DNA斷裂、DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)、構(gòu)成DNA的基礎(chǔ)物質(zhì)發(fā)生改變。8-OHdG是氧自由基誘導(dǎo)鳥嘌呤C-8發(fā)生羥基改變的產(chǎn)物，因此8-OHdG常作為氧化性DNA損傷的標(biāo)志[4]。本試驗(yàn)中，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量、8-OhdG水平均明顯升高，表明鎘暴露引起了錦鯉腎臟氧化損傷。

谷胱甘肽是一種非酶抗氧化物質(zhì)，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生、減少氧化反應(yīng)發(fā)生中起重要作用。已有研究表明，鎘暴露能夠誘導(dǎo)GSH含量的升高，可能是由于對(duì)抗其引起的氧化應(yīng)激損傷[10]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)96 h鎘暴露同樣引起了GSH含量的升高。GR、GCL是維持GSH含量的重要酶，GR能夠催化氧化型谷胱甘肽轉(zhuǎn)化為GSH，GCL是GSH生物合成的限速酶。GST是谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)的關(guān)鍵酶，催化該反應(yīng)的起始步驟。GPx是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶。GST、GPx、GR、GCL、GSH在機(jī)體抗氧化中發(fā)揮重要作用。鎘暴露引起GSH水平升高，以及GR、GCL、GST、GPX活性上升，提示機(jī)體在盡力調(diào)動(dòng)谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)以對(duì)抗鎘引起的氧化損傷。本試驗(yàn)結(jié)果為研究鎘引起動(dòng)物組織損傷的機(jī)制提供依據(jù)。

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