我國麻類作物基因工程育種研究進展

李仕金 辛培堯 周 軍

摘要對國內(nèi)外幾種主要的麻類作物基因工程研究進行了綜述,并對今后麻類作物在該領(lǐng)域的工作提出了展望。

關(guān)鍵詞麻類作物;基因工程;育種;研究進展

中圖分類號S563;Q789文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)08-0105-02

麻是一種古老的纖維植物,主要有紅麻(Hibiscus cannab-inus)、黃麻(Corchorus capsularis)、亞麻(Linum numusitatissimum)、苧麻(Boehmeria nivea)、大麻(Cannabis stative)等,它們在植物分類中并不屬于同一科或?qū)?但它們都有質(zhì)地堅韌的纖維,可作為紡織業(yè)和造紙業(yè)的原材料。我國是世界主要產(chǎn)麻國之一,也是麻類作物品種最多的國家。麻類作物還是包裝及繩索等制造工業(yè)的重要原料,是一種重要的經(jīng)濟作物。因此,愈來愈多的科研工作者對麻類作物進行了利用各種手段改良其產(chǎn)量及品質(zhì)的研究工作。

基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其他載體分子,構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合,并使之滲入到原先沒有這類分子的寄主細胞內(nèi),且能持續(xù)穩(wěn)定的繁殖[1]。自1983年利用基因工程手段首次獲得轉(zhuǎn)基因植株以來(煙草),這一技術(shù)在短短的20多年時間里得到了迅猛發(fā)展。到2001年,全球共正式批準各種轉(zhuǎn)基因植物120多個品種(系),已有15個以上的國家種植轉(zhuǎn)基因植物,總面積已超過5 200萬公頃[2]。1983年Hepburn等用根癌農(nóng)桿菌侵染亞麻上胚軸得到亞麻腫瘤株系,自此開始了麻類作物基因工程的育種研究?；蚬こ虘糜诼轭愖魑?在其種質(zhì)資源的創(chuàng)新中逐漸顯示出了強大的生命力和巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

1抗病蟲害基因工程方面的研究

經(jīng)過多年的相關(guān)研究,國內(nèi)外研究工作者在紅麻、亞麻、苧麻等麻類作物的抗病蟲害轉(zhuǎn)基因研究中取得了可喜的成就。其中以紅麻轉(zhuǎn)抗病蟲基因工程研究居多。

中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所與國際黃麻組織(IJO)合作,用農(nóng)桿菌介導法將抗真菌病害基因(幾丁質(zhì)酶基因與β-1, 3-葡聚糖酶基因)和抗蟲基因(Bt基因)導入紅麻子葉細胞,得到了轉(zhuǎn)基因后代植株[3]。據(jù)報道,福建農(nóng)林大學的研究者利用雙價抗蟲基因Pta-3300-Bt混合導入紅麻優(yōu)良品種中,已獲得1 500多個轉(zhuǎn)基因品系,正在進行株系的田間和實驗相結(jié)合的系統(tǒng)鑒定,有望選育出抗蟲轉(zhuǎn)基因紅麻新品種[4]。祁建民等用花粉管法將抗蟲質(zhì)粒DNA導入受體紅麻品種福紅952,在受體品種中獲得了Bt抗蟲目的基因的表達。分別用PCR和Southern雜交技術(shù),對所轉(zhuǎn)化的紅麻轉(zhuǎn)基因4個世代的株系進行分子驗證,結(jié)果在4個世代中都檢測到Bt抗蟲目的基因片段,說明外源基因已經(jīng)整合到紅麻的基因組中并獲得了穩(wěn)定遺傳[5]。

亞麻方面,王毓美等用含有幾丁質(zhì)酶(rc24)基因(上游為CaMV35S啟動子和Act1啟動子,下游為NOS終止子)和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(npt 1I)基因的農(nóng)桿菌LBA4404內(nèi)含已去除了T-DNA上致癌基因的pYAO24質(zhì)粒為供體進行亞麻轉(zhuǎn)化,得到了具有100mg/L抗性的轉(zhuǎn)化植株;對植株葉片愈傷組織的過氧化物酶及酯酶同工酶分析表明轉(zhuǎn)化株與對照系具有明顯的差異,推斷幾丁質(zhì)酶基因已經(jīng)進入亞麻基因組[6]。

苧麻抗病蟲害轉(zhuǎn)基因研究也取得了一定的進展。陳建榮等用農(nóng)桿菌LBA4404(pBI121-antiBNCCoA OMT)侵染苧麻的試管苗葉片,建立了苧麻葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系,并獲得了抗卡那霉素植株[7]。孔華等通過含有輪狀病毒外殼抗原蛋白VP4基因的根癌農(nóng)桿菌,用葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化苧麻栽培品種圓葉青,初步獲得了輪狀病毒外殼蛋白VP4的轉(zhuǎn)基因苧麻植株[8]。另有研究者通過農(nóng)桿菌介導法將Bt基因?qū)肫r麻體內(nèi),獲得了16株轉(zhuǎn)化植株,經(jīng)點雜交和PCR-Southern分析,有12株苧麻轉(zhuǎn)化植株基因組中整合有外源Bt基因[9]。上述研究成果,為麻類作物抗病蟲害轉(zhuǎn)基因新品種以及種質(zhì)資源的創(chuàng)新奠定了初步的物質(zhì)基礎(chǔ),也為該領(lǐng)域的研究提供了經(jīng)驗以及理論基礎(chǔ)。

2抗除草劑轉(zhuǎn)基因研究

麻類作物中,抗除草劑轉(zhuǎn)基因研究目前只在紅麻、亞麻中取得了一些成就,其他麻類作物的研究鮮見報道。

曹德菊等用花粉管法將外源抗除草劑Bar基因?qū)爰t麻,并對有效導入方法及參數(shù)進行了研究,通過PCR檢測及Southern雜交對所獲得的轉(zhuǎn)抗除草劑基因紅麻進行了分子水平的驗證,發(fā)現(xiàn)外源抗除草劑基因已整合進紅麻基因組中[10,11]。王玉富等以纖維用亞麻品種黑亞11號為材料,利用農(nóng)桿菌介導法將Bar基因轉(zhuǎn)入亞麻,經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)目的基因已經(jīng)整合到亞麻基因組中[12]。隨著除草劑的廣泛使用,其藥害已經(jīng)成為影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素之一,危害僅次于有害生物造成的損失。因此,開展抗除草劑育種,是作物育種的新育種目標之一,該方面的研究有待加強。作為一種新的育種輔助手段,基因工程憑借其目的性強的優(yōu)越性,必將在這一研究領(lǐng)域取得更大的成功。

3抗逆性轉(zhuǎn)基因研究

干旱、病蟲害、草害、凍害及鹽堿害等脅迫因子給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來的危害相當巨大,每年造成的直接經(jīng)濟損失可達數(shù)萬美元,且有逐年增加的趨勢。因此,培育抗逆性作物新品種,是未來農(nóng)業(yè)發(fā)展的必由之路,在目前全球氣候惡化的情況下,更具有長遠意義。目前,各種作物都已開展了抗逆性轉(zhuǎn)基因育種,并取得一定的成就,而麻類作物的抗逆性轉(zhuǎn)基因研究主要在紅麻、亞麻中有見報道。

福建農(nóng)林大學用花粉管通道法將耐鹽基因SaNHXP導入優(yōu)良紅麻品種福紅992,從1 500個轉(zhuǎn)基因株系中篩選出5個耐7‰鹽堿度的抗鹽堿植株,目前正在進行田間和室內(nèi)鑒定試驗[4]。康慶華等用農(nóng)桿菌介導法將抗鹽和低溫脅迫基因HY15CS導入單倍體亞麻,獲得抗性再生植株24株,從15株生長健壯的再生植株中用PCR檢測到3株陽性植株,陽性率達20%[13]。

4品質(zhì)育種轉(zhuǎn)基因研究

麻類作物品質(zhì)育種基因工程方面的報道較少,僅紅麻和黃麻各1例。浙江省蕭山棉麻研究所以改良紅麻纖維品質(zhì)為目的的外源DNA導入紅麻獲得了成功[14]。林荔輝等將黃麻基因組DNA通過花粉管通道法導入紅麻中,并首次獲得2份莖稈光滑無刺的稀有紅麻早熟突變體901和902,并通過雜交、回交和多代定向選擇的遺傳改良,育成了莖桿光滑無刺的紅麻新型品種金山無刺,并從中選育出中偏遲熟油麻兼用紅麻新型品種金光1號[15]。

5麻類作物相關(guān)基因克隆方面

麻類作物基因克隆的研究內(nèi)容,主要集中于亞麻和苧麻2種作物。亞麻是一種重要的韌皮纖維作物,木質(zhì)素對亞麻纖維的性能和品質(zhì)具有較大影響。高原等以亞麻莖桿表皮細胞的mRNA為模板,利用木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵酶基因的同源基因保守序列設計簡并引物,通過RT-PCR擴增,獲得了8個關(guān)鍵酶基因新的片段序列。進一步生物信息學分析結(jié)果表明,這些新片段分別屬于3個基因家族。他們推測亞麻中這幾個木質(zhì)素代謝關(guān)鍵調(diào)控酶基因存在多基因家族。新獲得的基因片段序列為進一步克隆全序列和了解調(diào)控亞麻木質(zhì)素的生物合成奠定了基礎(chǔ)[16]。另有研究者以亞麻為材料,研究木質(zhì)素代謝的關(guān)鍵酶亞麻肉桂醇脫氫酶基因序列。分離了高純度的RNA,以RNA為模板,用簡并引物以RT- PCR的方法,克隆了亞麻CAD基因cDNA部分序列,長度為477bp,編碼159個氨基酸殘基,此cDNA序列為亞麻CAD基因序列[17]。

苧麻方面,陳建榮等用RT-PCR方法克隆了嫻草木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶咖啡酰甲基轉(zhuǎn)移酶(eafeoyl-CoA 3-O-methyltransferase,CCoAOMT)基因,構(gòu)建了CCoAOMT基因反義表達載體,通過農(nóng)桿菌介導法對苧麻進行轉(zhuǎn)化,得到了轉(zhuǎn)基因植株,并用PCR技術(shù)對其進行了分子檢測[18]。有人利用RT-PCR法結(jié)合cDNA末端快速擴增法(RACE)從苧麻中克隆了與木質(zhì)素合成相關(guān)的COMT基因的全長cDNA序列。相似性比對結(jié)果表明,苧麻COMT全長cDNA與楊樹COMT基因的序列同源性達82%,其編碼的氨基酸序列與杏的COMT氨基酸序列同源性最高,達93%[19]。黃妤等以苧麻栽培種湘苧3號為材料,通過簡并引物RT-PCR結(jié)合RACE 技術(shù)克隆了苧麻生長素結(jié)合蛋白ABP1基因的全長cDNA分子。經(jīng)基因比對及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析與已報道的幾種植物生長素結(jié)合蛋白有高同源性,認為是苧麻生長素結(jié)合蛋白基因cDNA并命名為BnABP1[20]。也有人依照已克隆的苧麻CCoAOMT(咖啡酰輔酶-A-氧甲基轉(zhuǎn)移酶)基因cDNA序列,以其編碼纖維素合成酶底物結(jié)合和催化合成結(jié)構(gòu)域的cDNA序列為目標,采用PCR擴增方法引入克隆的酶切位點,分別將其正、反方向克隆到植物RNA干擾表達質(zhì)粒PFGC5941 T-DNA上CHSA內(nèi)含子兩側(cè),構(gòu)建了植物表達苧麻CCoAOMT基因的干擾重組Ti載體[21]。

6其他方面研究

與此同時,麻類作物基因工程育種在其他方面也取得了喜人的成就。

劉燕等[22]、王玉富等[23]用微注射法將外源DNA 通過花粉管導入亞麻,并得到了過氧化物同工酶酶譜明顯變異的后代。姬妍茹等采用直接分化再生系統(tǒng)為轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng),通過農(nóng)桿菌介導將GUS 基因?qū)雭喡槠贩N雙亞5號和雙亞7號的下胚軸段中,經(jīng)過不到2個月的時間即獲得再生苗。這一成果大大縮短了遺傳轉(zhuǎn)化所需時間,為亞麻轉(zhuǎn)基因育種提供了一條快捷的途徑[24]。也有研究人員用超干胚浸漬法將棉花DNA導入苧麻種子,在D1代,發(fā)現(xiàn)了在葉片的缺刻、茸毛上存在差異的變異株;而在D2代,則發(fā)現(xiàn)了在株高上有明顯不同的植株。經(jīng)過RAPD驗證,發(fā)現(xiàn)有的變異株中出現(xiàn)了棉花的特異帶,有的則出現(xiàn)受體和供體均沒有的新帶,還有的出現(xiàn)了受體DNA帶在變異株中消失的情況[25]。另外,汪波等以苧麻優(yōu)良品系“5041-3”子葉作為受體,利用根癌農(nóng)桿菌介導法進行了綠色熒光蛋白基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究,并將外源基因整合到苧麻基因組中[26]。陳德福等分別用根癌農(nóng)桿菌C58C1和發(fā)根農(nóng)桿菌A4轉(zhuǎn)化苧麻“湘苧3號”種子苗繁殖的試管苗葉切片。根癌農(nóng)桿菌C58C1感染的葉切片在12d時,即有肉眼可見的的愈傷組織產(chǎn)生。發(fā)根農(nóng)桿菌A4轉(zhuǎn)化的葉片在第21天時無愈傷組織產(chǎn)生,但有少量根產(chǎn)生[27]。

麻類作物該方面的研究為利用轉(zhuǎn)基因方法創(chuàng)造麻類作物新品種的育種工作,提供了豐富的前期基礎(chǔ)。

7展望

麻類作物是重要的纖維和油料作物,對它進行基因工程方面的研究有著重要的意義和廣闊的應用前景。通過目的基因的分離、改造、利用,培育出具有改良的纖維及種子品質(zhì)的工程植株并使之應用于生產(chǎn)實踐,可提高農(nóng)民的經(jīng)濟收入,改善生態(tài)環(huán)境。目前,對麻類作的轉(zhuǎn)基因育種研究,與棉花和油料等相比,還處于深入起步階段。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展和完善,會有越來越多的轉(zhuǎn)基因麻類植物新品種出現(xiàn),到時將大大提高麻類作物的利用價值。如在改善纖維品質(zhì)方面,若能把控制品質(zhì)的關(guān)鍵基因定位并加以克隆,有望大幅提升麻類纖維質(zhì)量。對大麻中有毒成分THC的合成關(guān)鍵酶基因定位克隆,并對其活性進行深入的研究,則有望培育出無毒或低毒大麻,從而使大麻這種古老經(jīng)濟作物的種植不再受限。可以預見,基因工程手段應用于麻類作物,具有巨大的社會與經(jīng)濟效益。

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