花生內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的擴(kuò)增及序列分析

楊 森

摘要設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物,以花生栽培種四粒紅及其與野生種光葉花生的種間雜種為材料,對(duì)花生ITS1-5.8S-ITS2序列進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增,獲得長(zhǎng)度約800bp的單一條帶,在對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序的基礎(chǔ)上構(gòu)建了花生屬進(jìn)化樹。

關(guān)鍵詞花生;內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列;PCR;進(jìn)化樹

中圖分類號(hào)Q789文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)08-0103-02

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)廣泛應(yīng)用于被子植物系統(tǒng)進(jìn)化研究,為禾本科、大豆屬、棉屬等植物的系統(tǒng)進(jìn)化研究提供了寶貴的分子遺傳學(xué)依據(jù)。花生rDNA有關(guān)研究報(bào)道較少,盡管有分離 rDNA ITS的報(bào)道,但未在此基礎(chǔ)上進(jìn)行花生屬植物的系統(tǒng)發(fā)育分析。本研究對(duì)花生ITS序列進(jìn)行分離、測(cè)序,并將其與GenBank中登錄的花生ITS序列進(jìn)行比較和分析,為花生的系統(tǒng)演化及花生的分類鑒定提供分子水平的證據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)所用花生為栽培種四粒紅(Silihong)及四粒紅與野生種光葉花生的雜交后代(Silihong×Arachis glabrata Benth.)高世代材料?；ㄉN子取自山東省花生研究所萊西試驗(yàn)站。

根據(jù)Bhagwat等報(bào)道的ITS序列,使用軟件DNAS-TAR.Lasergene.v7.1設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物:

ITS1&2-1∶5-GTCGATGCCGCACAAACCAGGATT-3

ITS1&2-2∶5-CGGGCACAACGGGGCTCTCA-3

這對(duì)引物的擴(kuò)增區(qū)包含ITS1、5.8S和ITS2完整區(qū)域。引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2方法

取3~5?；ㄉ闯墒斓娜~片置于1.5mL離心管中,加40μL 0.25mol/L NaOH,用1mL槍頭套一PCR管將葉片搗碎,煮沸30s,加160μL含PVP-40的Tris-HCl(pH值7.6),煮沸2min,10 000rpm離心5min,取上清液4℃保存,用時(shí)取1μL作模板。取1-1D4-1、1-4D4-1、四粒紅各品種未成熟葉片按上述步驟作簡(jiǎn)單處理,依次編號(hào)為1、2、3作為PCR模板。

PCR程序?yàn)?94℃ 5min,(94℃ 1min,52.1℃ 1min,72℃ 1.5min)30個(gè)循環(huán),72℃ 10min。先用Takara Taq DNA聚合酶作PCR,確定有預(yù)期分子量大小的條帶后再用高保真Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增,切膠回收DNA,連接轉(zhuǎn)化后挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。利用DNASTAR.Lasergene.v7.1進(jìn)行多序列比對(duì)。

用Mega4.0軟件以擬南芥核rDNA序列為外群組(outgroup),采用3種方法(NJ、ME、MP)構(gòu)建進(jìn)化樹,并進(jìn)行bootstrap analysis 1 000檢驗(yàn)[2]。

2結(jié)果與分析

2.1ITS區(qū)序列的PCR擴(kuò)增

以總DNA為模版,利用所設(shè)計(jì)的 2條引物PCR擴(kuò)增出ITS區(qū)的特異性條帶,分子量在800bp左右(圖1),與GenBank所登錄的ITS序列片段長(zhǎng)度相近。用Taq DNA Pol PCR體系和pfu DNA Pol PCR體系所擴(kuò)增出的ITS區(qū)序列片段電泳遷移率相同。

2.2ITS1-5.8S-ITS2序列測(cè)定與多序列比對(duì)

四粒紅與野生種光葉雜交后代擴(kuò)增產(chǎn)物6份穿刺培養(yǎng)物測(cè)序得到3條有差異的條帶,分別命名為1-1、1-2、1-4。四粒紅擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后得到的序列命名為3-3。

通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)4條序列在ITS1-5.8S-ITS2區(qū)共有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)14個(gè),其中6個(gè)位于ITS1區(qū),2個(gè)位于5.8S rDNA中,6個(gè)位于ITS2區(qū),其他植物上的研究認(rèn)為5.8S rDNA在進(jìn)化上相當(dāng)保守,而ITS1和ITS2則變化很大,本試驗(yàn)結(jié)果與這一結(jié)論一致。

2.3花生屬進(jìn)化樹構(gòu)建

通過(guò)NJ、ME和MP法構(gòu)建花生屬進(jìn)化樹,其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)大致相似,但也有所區(qū)別?？傮w看來(lái),各個(gè)區(qū)組的材料分別聚集到一起,與基于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征的花生屬區(qū)組劃分基本一致。從本研究所構(gòu)建的3棵進(jìn)化樹來(lái)看,圍脈(Ex)區(qū)組、三籽粒(Tris)區(qū)組、大根(C)區(qū)組在花生屬中是比較原始的,花生區(qū)組(A)進(jìn)化程度較高;Gregory等根據(jù)花生屬種間可交配性提出圍脈(Ex)區(qū)組、直立(Er)區(qū)組和根莖(R)區(qū)組原根莖系較原始,而花生(A)區(qū)組、三籽粒(Tris)區(qū)組、大根(C)區(qū)組、異形花(H)區(qū)組、匍匐(P)區(qū)組以及根莖(R)區(qū)組真根莖系進(jìn)化程度較高。

研究結(jié)果表明,圍脈(Ex)區(qū)組、三籽粒(Tris)區(qū)組和異形花(H)區(qū)組親緣關(guān)系較近;直立(Er)區(qū)組和三葉(Trie)區(qū)組關(guān)系密切,兩者與匍匐(P)區(qū)組形成一大的分支。

在本研究構(gòu)建進(jìn)化樹所涉及的花生材料當(dāng)中,有3個(gè)未命名的種,其區(qū)組歸屬尚不明確,但從所構(gòu)建的進(jìn)化樹上看,A.sp.DAP-2004-1、A.sp.DAP-2004-2應(yīng)屬于花生(A)區(qū)組,A.sp.DAP-2004-3可能屬于直立(Er)區(qū)組或匍匐(P)區(qū)組。

本研究所得4條序列均與花生區(qū)組的序列聚為一類,其中1-1、1-4與四粒紅(3-3)關(guān)系相近,而1-2與其關(guān)系較遠(yuǎn),說(shuō)明種間雜種既與母本有相似的地方,也與母本有一定的差異,為雜種的真實(shí)性提供了分子水平證據(jù)。

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