論新型疫苗的研究概況與進(jìn)展

李文藝

摘要 隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，近年來(lái)出現(xiàn)了各種不同的新型疫苗，這類疫苗的出現(xiàn)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)疫苗的缺點(diǎn)，也填補(bǔ)了疫苗種類的空白。就重組活載體疫苗、樹突狀細(xì)胞疫苗、T細(xì)胞疫苗、食物疫苗、DNA疫苗、RNA復(fù)制子疫苗、多肽疫苗和抗獨(dú)特型抗體疫苗等8種新型疫苗的研究概況與進(jìn)展進(jìn)行論述。

關(guān)鍵詞 新型疫苗；研究概況；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào) Q342+.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2009）05-0220-03

疫苗是一種用于預(yù)防和治療傳染病或某些慢性疾病的生物制品，實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的是傳統(tǒng)滅活疫苗和減毒活疫苗，但兩者在生產(chǎn)實(shí)際中均存在著免疫效果不確實(shí)、非特異性反應(yīng)強(qiáng)、保護(hù)期短等缺點(diǎn)，這就使得新型疫苗的出現(xiàn)成為必然，各種新型疫苗的研制越來(lái)越多地受到關(guān)注。新型疫苗是應(yīng)用基因工程技術(shù)和生物化學(xué)合成技術(shù)生產(chǎn)的疫苗。筆者就目前出現(xiàn)的幾類新型疫苗作一論述。

1 重組活載體疫苗

活載體疫苗是將編碼病原微生物特異性抗原的基因片段插入減毒的活細(xì)菌或病毒載體基因組的某些部位，使之高效表達(dá)，從而誘生強(qiáng)有力的抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，使機(jī)體獲得對(duì)插入基因相關(guān)疾病的抵抗力。

1.1 重組細(xì)菌疫苗

可作為基因工程疫苗載體的細(xì)菌很多，但從疫苗的安全性和能誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)的角度出發(fā)，減毒沙門菌和卡介苗是最佳載體。在2003年SARS爆發(fā)后，研究者們首先考慮用滅活的SARS-Cov來(lái)抵御SARS。一般用福爾馬林、紫外線或β-丙內(nèi)酯滅活SARS-Cov。用紫外線滅活的SARS-Cov免疫小鼠可產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，加強(qiáng)免疫后可觀察到細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)[1] 。He等[2]報(bào)道β-丙內(nèi)酯滅活的SARS-Cov免疫小鼠和兔子都可產(chǎn)生高滴度的抗體，這些抗體能夠識(shí)別S蛋白特別是RBD，并阻止RBD與ACE2的結(jié)合。純化的滅活SARS疫苗免疫猴子可產(chǎn)生高水平的中和抗體，并能阻止SARS-Cov在猴子體內(nèi)的復(fù)制，該疫苗對(duì)猴子是安全且有效的[3]。SARS滅活疫苗的Ⅰ期臨床試驗(yàn)在我國(guó)已完成，II期臨床試驗(yàn)方案已擬訂，該疫苗的安全性和有效性有待于進(jìn)一步評(píng)估。由于滅活疫苗不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫、免疫原性低、產(chǎn)生免疫力慢及在制備過(guò)程中存在較大危險(xiǎn)等缺點(diǎn)，故在T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位被鑒定后，SARS滅活疫苗可能將被取代。

1.2 重組病毒疫苗

以病毒為載體的基因工程疫苗可視為病毒減毒活疫苗和亞單位蛋白質(zhì)疫苗的結(jié)合，既可避免亞單位疫苗需要佐劑及多次接種注射的缺點(diǎn)，又可誘導(dǎo)全面而持久的免疫反應(yīng)，可作為減毒活疫苗的病毒載體有痘苗病毒、腺病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒及單純皰疹病毒等，其中最常用的是痘苗病毒和腺病毒。

痘苗病毒是基因工程中的常用載體，是人類使用了近200年的最為安全的疫苗[4]，而且牛痘苗病毒能感染許多不同類型的細(xì)胞，能容納大分子外源基因，能在感染的早期或晚期高水平地表達(dá)外源基因，且病毒的耐熱性強(qiáng)，易獲得高效價(jià)的抗體，是十分理想的載體；能表達(dá)牛瘟病毒血凝素或融合糖蛋白抗原的牛痘病毒基因工程疫苗，能產(chǎn)生高效價(jià)的中和抗體，并可使牛獲得攻毒保護(hù)[5-7]是一個(gè)成功的例子。禽痘弱毒疫苗株已廣泛用于生產(chǎn)禽病重組疫苗。利用禽流感病毒的保護(hù)性抗原HA和NA、HA糖蛋白和NA蛋白能夠產(chǎn)生有保護(hù)作用的抗體，NP有種特異性，能產(chǎn)生有保護(hù)作用的抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)。臺(tái)灣謝快樂(lè)等用臺(tái)灣AIV分離株（H8N4）的外膜蛋白HA和NA制作了免疫復(fù)合物亞單位疫苗，同時(shí)制作了滅活的油佐劑疫苗，用血凝抑制試驗(yàn)作為評(píng)價(jià)2種疫苗免疫效果的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表現(xiàn)差異不明顯，只是在加強(qiáng)免疫時(shí)亞單位疫苗抗體升高比油佐劑苗明顯。Kodihalli S等[8]研制了火雞H5N2病毒HA和核蛋白（NP）復(fù)合亞單位疫苗，發(fā)現(xiàn)該疫苗可以對(duì)同源和異源亞型病毒的攻擊產(chǎn)生保護(hù)作用。常規(guī)制備亞單位疫苗的過(guò)程復(fù)雜、成本高，而重組DNA和分了克隆技術(shù)的發(fā)展恰恰為克服以上缺點(diǎn)提供了可能。John Crawford等[9]利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了H5、H7亞型AIV的HA佐劑疫苗，用這2種疫苗分別免疫3周齡Rock雞，對(duì)高致病性強(qiáng)毒的攻擊均能產(chǎn)生100%的保護(hù)。

基因重組活載體原理制備禽流感疫苗的技術(shù)已趨于成熟。2002年，程堅(jiān)等[10]把H9亞型禽流感病毒HA基因、雞II型干擾素（IFN-II）基因分別置于痘苗病毒P7.5啟動(dòng)了和雞痘病毒早晚期啟動(dòng)了PE/ L下游，構(gòu)建了共表達(dá)H9亞型禽流感病毒HA和雞IFN-II的重組雞痘病毒。動(dòng)物試驗(yàn)表明，該重組病毒能顯著抑制靜脈攻毒后的1日齡SPF雞及含母源抗體的商品雞從泄殖腔排毒，并能減輕單表達(dá)HA的重組雞痘病毒抑制1日齡SPA雛雞增重的副作用。我國(guó)哈爾濱的Qiao C. L.等[11]在2003年構(gòu)建了能同時(shí)表達(dá)H5N1亞型HA基因和NA的重組禽痘病毒重組疫苗，攻毒結(jié)果顯示該疫苗具有良好的免疫保護(hù)性。

2 樹突狀細(xì)胞疫苗

樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是動(dòng)物體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，具有攝取、加工抗原，以組織相容性復(fù)合體（MHC I和MHC II ）肽結(jié)合物的形式遞呈抗原，并促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖的能力。研究發(fā)現(xiàn)DC能強(qiáng)有力地激活幼稚型T細(xì)胞，少量的抗原和樹突狀細(xì)胞即足以激活T細(xì)胞[12-15]，并且可誘導(dǎo)很強(qiáng)的初次免疫應(yīng)答，前期的體外試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)表明，以適當(dāng)形式的腫瘤抗原，不論是蛋白質(zhì)、多肽還是核酸加載的DC疫苗，都能夠激活殺傷腫瘤細(xì)胞的抗原特異性T細(xì)胞，并可產(chǎn)生免疫記憶效應(yīng)。荷載抗原的DC具有疫苗的功能，因此稱為樹突狀細(xì)胞疫苗。

DC疫苗主要有三大類，即細(xì)胞性腫瘤抗原修飾的DC，腫瘤抗原肽修飾的DC和腫瘤抗原基因轉(zhuǎn)染的DC[16]。

3 T細(xì)胞疫苗

T細(xì)胞疫苗指將能引起遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的T細(xì)胞作為疫苗接種，用于治療某些自身免疫性疾病。后來(lái)發(fā)現(xiàn)依據(jù)MHC I類分子特異的多肽結(jié)合基序（MHC binding motif）合成的多肽，在體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗原特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞可用于治療病毒性疾病，這種體外活化的T細(xì)胞也稱為T細(xì)胞疫苗[12]。

由T細(xì)胞引起的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)可能是某些自身免疫性疾病的病因，因此將可致病的T細(xì)胞滅活后作為疫苗注入體內(nèi)，用于治療某些自身免疫性疾病[13]。小鼠變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的試驗(yàn)已獲成功，在人類多發(fā)性硬化癥中也有一定效果。

病毒特異性的T細(xì)胞（cytoxic T lymphocyte，CTL）介導(dǎo)的細(xì)胞免疫具有清除病毒的功能，是宿主防御病毒感染的主要機(jī)制之一。傳統(tǒng)病毒疫苗（減毒苗和滅活苗），含有完整的病毒蛋白以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體為主，難以有效誘導(dǎo)產(chǎn)生MHC I類分子限制性的CTL和清除感染細(xì)胞內(nèi)的病毒顆粒。T細(xì)胞疫苗是用多肽在體外誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性CTL，經(jīng)過(guò)克隆、擴(kuò)增、篩選和鑒定后，將MHC I類分子限制的CD8+T細(xì)胞輸人機(jī)體，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答[14]。

4 食物疫苗

食物疫苗包括植物性食物疫苗和動(dòng)物性食物疫苗兩大類[17]。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，通過(guò)基因工程改造的轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物已成為一種新型的生物反應(yīng)器，作為疫苗生產(chǎn)系統(tǒng)。

植物性食物疫苗的概念是由Mason等（1992）提出轉(zhuǎn)基因植物時(shí)產(chǎn)生的，研究表明，細(xì)菌性和病毒性病原體抗原可以在植物中表達(dá)，且表達(dá)后的抗原仍能保留天然抗原的免疫原性[13]。利用植物病毒為載體，經(jīng)遺傳改建，使其攜帶外源抗原基因片段，此重組植物病毒感染植物組織后，通過(guò)在宿主植物中的增殖，得到外源抗原基因編碼產(chǎn)物。也可將編碼保護(hù)性抗原蛋白的結(jié)構(gòu)基因克隆人Ti質(zhì)粒，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化作物桿菌，然后再用攜帶重組質(zhì)粒的作物桿菌感染植物細(xì)胞把導(dǎo)入的外源基因整合到這些植物細(xì)胞的染色體基因組中，含外源基因染色體的植物細(xì)胞在一定條件下可以生長(zhǎng)成新生的植株，該植株可以在生長(zhǎng)過(guò)程中表達(dá)外源基因，并將此性狀傳給子代，成為表達(dá)疫苗的品系[18]。

煙草是轉(zhuǎn)基因植物研究的模式表達(dá)系統(tǒng)，已有多種外源基因在轉(zhuǎn)基因煙草中成功表達(dá)，如乙型肝炎病毒表面抗原（Hepatitis A virus surface anti-gen，HBsAg）、霍亂毒素B亞單位、nor-walk病毒膜蛋白等。特別是轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗的優(yōu)勢(shì)非常明顯，水果、黃瓜、胡蘿卜和番茄等植物是可以生食的，合適的抗原基因只要在該植物可食用部位的器官特異表達(dá)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，經(jīng)轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)基因植物即可直接用于口服免疫。在植物中高效表達(dá)產(chǎn)生的抗原作為食物時(shí)，可刺激體液和黏膜免疫應(yīng)答并能安全通過(guò)動(dòng)物消化道而不被蛋白酶降解，成為黏膜性抗原。Amtzen等將大腸埃希菌內(nèi)毒素基因?qū)腭R鈴薯中，得到的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖被小鼠食用后在小鼠體內(nèi)檢測(cè)出內(nèi)毒素的抗體。迄今為止，國(guó)外已經(jīng)有幾十種藥用蛋白或多肪在植物中得到表達(dá)，有的已投入商品化生產(chǎn)。

開發(fā)動(dòng)物性食物疫苗是一個(gè)迅速發(fā)展起來(lái)的新領(lǐng)域。將編碼保護(hù)性抗原的目的基因片段通過(guò)載體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞使其表達(dá)并分布于肉、蛋或乳中，以轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為生物反應(yīng)器。另外，國(guó)內(nèi)外一些研究人員把某種抗原通過(guò)肌肉注射或口服進(jìn)入奶牛/羊體內(nèi)刺激其免疫系統(tǒng)，提高其乳汁的特異性抗體含量，采用低溫噴霧干燥技術(shù)生產(chǎn)出免疫奶粉，可保持其中特異性抗體的活性。

可見，無(wú)論是植物性食物疫苗還是動(dòng)物性食物疫苗，在未來(lái)的疫苗領(lǐng)域都有著很大的發(fā)展空間，而且它們具備傳統(tǒng)疫苗所不具備的優(yōu)勢(shì)，故受到越來(lái)越多的關(guān)注。

5 DNA疫苗

DNA疫苗又稱基因疫苗或核酸疫苗，是將編碼某種目的抗原蛋白的基因克隆到哺乳動(dòng)物真核表達(dá)載體置于真核表達(dá)元件的控制之下，并將其直接導(dǎo)入動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，通過(guò)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，從而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。

DNA疫苗有很多傳統(tǒng)疫苗所不具有的優(yōu)點(diǎn)，例如，沒(méi)有感染的危險(xiǎn)，可誘發(fā)針對(duì)天然蛋白表位的抗體和特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，可維持長(zhǎng)期持續(xù)的免疫反應(yīng)，便于構(gòu)建多價(jià)疫苗，穩(wěn)定性不受溫度影響，可快速篩選具有免疫保護(hù)效果的基因以及具備預(yù)防和免疫治療的雙重功能等。最常見的DNA疫苗接種方案是間隔2~3周連續(xù)多次注射，但如果將DNA疫苗與蛋白質(zhì)疫苗交替注射有可能獲得更好的效果。由于DNA疫苗是一種新型疫苗，目前大多數(shù)DNA疫苗處于第I期臨床試驗(yàn)階段，其主要目的是證明疫苗的安全性和免疫原性。數(shù)年的臨床觀察尚未發(fā)現(xiàn)疫苗的DNA分子會(huì)整合到染色體中去或誘發(fā)自身免疫病的可能性。令人鼓舞的是瘧疾DNA疫苗的臨床試驗(yàn)已進(jìn)入第Ⅲ期，預(yù)計(jì)不久將正式作為商品上市[19]。目前，正在研發(fā)中的SARS-Cov DNA疫苗主要有以下幾種。

5.1 基于S蛋白的DNA疫苗

基于S蛋白的DNA疫苗既能誘導(dǎo)中和抗體，也能誘導(dǎo)特異的CTI，因此被認(rèn)為是有前景的疫苗之一。Yang等[20]報(bào)道用編碼SARS-Cov S蛋白的DNA疫苗免疫小鼠，不僅能誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，也能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，并使肺部病毒的濃度降低6倍。此外，已有文獻(xiàn)報(bào)道抗S蛋白的抗體可中和同源的SARS-Cov毒株，但這些抗體可促進(jìn)人的早期SARS-Cov分離株GD 03T0013和貓科SARS-Cov樣病毒的感染[21]。S蛋白含有幾個(gè)可誘導(dǎo)高滴度非中和性抗體的線性免疫優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu)域，非中和性抗體能否促進(jìn)SAR S-Cov 感染或介導(dǎo)有害的免疫應(yīng)答還不清楚。這些研究結(jié)果表明，應(yīng)對(duì)表達(dá)全長(zhǎng)S蛋白的DNA疫苗的安全性和有效性給予關(guān)注。RBD不僅是一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，而且含有S蛋白主要的中和表位。編碼RBD的DNA疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體的濃度比表達(dá)全長(zhǎng)S蛋白的DNA疫苗誘導(dǎo)的中和抗體濃度高。RBD與恢復(fù)期SARS病人的抗血清有較強(qiáng)烈的反應(yīng)，從抗血清中純化的抗體能抑制RBD與ACE2結(jié)合[2，22，23]。與全長(zhǎng)S蛋白不同，RBD不含誘導(dǎo)非中和性抗體的免疫位點(diǎn)，這表明RBD是一個(gè)理想的SARS疫苗候選者。

5.2 基于N蛋白的DNA疫苗

N蛋白是SARS-Cov的內(nèi)部蛋白，比其他蛋白如S、M等保守，這使它成為一個(gè)理想的疫苗候選者。成功的SARS疫苗應(yīng)能誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)的、廣譜的、持久的中和抗體和保護(hù)性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。N蛋白不僅能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，而且也能誘導(dǎo)廣泛的細(xì)胞免疫應(yīng)答。表達(dá)N蛋白的重組質(zhì)粒載體免疫小鼠3次后，可觀察到CTL和抗體應(yīng)答。鈣視網(wǎng)膜蛋白（Calreticulin，CRT ）與N蛋白融合的DNA疫苗免疫C57BL /6鼠，可產(chǎn)生N蛋白特異的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答[24]。Peng等[25]報(bào)道，所有SARS患者都存在SARS-Cov N蛋白特異性記憶CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，并且在抗原缺失的情況下可持續(xù)存在2年。M蛋白的表達(dá)可以促進(jìn)SARS-Cov N DNA疫苗免疫的Bulb/c鼠產(chǎn)生N蛋白特異性抗體，而且 M蛋白和N蛋白的共同免疫可降低SARS-Cov引起的死亡和肺部的病理變化[26]。M蛋白能夠增強(qiáng)N蛋白特異性抗體產(chǎn)生和T淋巴細(xì)胞活性的機(jī)制還不清楚。

5.3 表位疫苗

表位疫苗即用抗原表位制備的疫苗，含有合理設(shè)計(jì)的保護(hù)性表位，如B表位、T表位，可刺激效應(yīng)B細(xì)胞和T細(xì)胞免疫應(yīng)答。多表位抗原既能誘導(dǎo)體液免疫又能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，所以多表位疫苗被認(rèn)為是防治SARS最好的方式。S、E、M和N蛋白的表位已相繼被鑒定，不過(guò)已鑒定的表位多為B表位和中和表位，T表位較少。SARS-Cov的CTL表位可被90%的人白細(xì)胞抗原遞呈，這已被生物信息學(xué)所鑒定[27]。因此，研究SARS-Cov B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位的特點(diǎn)、T細(xì)胞應(yīng)答的MHC限制性及抗原遞呈的特異性對(duì)研發(fā)表位疫苗很重要。

盡管基因疫苗的發(fā)現(xiàn)為研究新型疫苗提供了一個(gè)新思路，是很多蛋白質(zhì)疫苗所不能比擬的，但畢竟處于試驗(yàn)階段，仍存在危險(xiǎn)性，如產(chǎn)生抗DNA抗體的可能性，外源DNA與宿主基因組DNA整合的可能性，免疫耐受性和自身免疫產(chǎn)生的可能性等[28]。

6 RNA復(fù)制子疫苗

RNA復(fù)制子疫苗是一種基于RNA病毒的復(fù)制子，能夠進(jìn)行自我復(fù)制的新型疫苗，保留了病毒的復(fù)制酶基因，結(jié)構(gòu)基因由外源基因所代替，復(fù)制酶可控制載體RNA在胞質(zhì)中高水平復(fù)制和外源基因高水平的表達(dá)。RNA復(fù)制子疫苗被包裝成病毒樣顆粒后，大大提高了穩(wěn)定性[29]。被感染的細(xì)胞能分泌釋放抗原（或者是細(xì)胞凋亡后釋放抗原），刺激B細(xì)胞生成抗體。同時(shí)，抗原被抗原遞呈細(xì)胞攝取，在內(nèi)體被降解成為肽段，與MHC II類分子結(jié)合，經(jīng)高爾基體運(yùn)至細(xì)胞表面，被含有TCR/CD3復(fù)合物的CD4+T細(xì)胞識(shí)別，發(fā)揮體液免疫作用。

7 多肽疫苗

按照病原體抗原基因中已知或預(yù)測(cè)的某段抗原表位的氨基酸序列，用人工方法合成抗原肽，或通過(guò)化學(xué)分解和有控制的蛋白水解，使天然蛋白降解為小片段，篩選出具有免疫活性的片段或有中和特性的單克隆抗體識(shí)別相關(guān)抗原表位，這種保護(hù)作用類似天然抗原決定簇的多肽，配以適當(dāng)載體與佐劑制成的疫苗稱多肽疫苗，如HBsAg的各種合成物、人工合成的白喉毒素14個(gè)氨基酸肽、流感病毒血凝素的18個(gè)氨基酸肽等。試驗(yàn)表明，多肽疫苗可以產(chǎn)生相應(yīng)的中和抗體，并對(duì)相應(yīng)病原微生物攻擊具有一定的保護(hù)力[30]。

8 抗獨(dú)特型抗體疫苗

免疫系統(tǒng)內(nèi)所有的抗體分子或淋巴細(xì)胞的抗原受體上都存在著獨(dú)特型（idiotype，Id）抗原決定簇，它能被體內(nèi)另一些淋巴細(xì)胞所識(shí)別并產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體（antiidiotype，AId或Ab2）[31]。目前，抗獨(dú)特型疫苗研究仍處于動(dòng)物試驗(yàn)研究階段，疫苗的范圍主要有病毒、細(xì)菌和原蟲等引起的疫病、惡性腫瘤及某些自身免疫性疾病。

新型疫苗的發(fā)展給人類以及動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療帶來(lái)新的希望，盡管新型疫苗有各種缺陷，但隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，新型疫苗經(jīng)過(guò)不斷改造，將會(huì)更理想的服務(wù)于人類。

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