豬瘟診斷方法研究進展探析

沈素芳　湯賽冬　成建忠

摘要 概述了豬瘟診斷方法的研究進展，包括血清學(xué)診斷方法和病原學(xué)診斷方法，為豬瘟診斷方法的實際應(yīng)用提供了技術(shù)幫助。

關(guān)鍵詞 豬瘟；診斷方法；血清學(xué)；病原學(xué)

中圖分類號 S858.285.3 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2009）05-0215-01

豬瘟（Classical Swine Fever，CSF）是由豬瘟病毒引起的一種高度傳染性的疫病，農(nóng)業(yè)部將其列為一類傳染病。豬瘟臨床可分為急性型、亞急性型、慢性型、非典型型豬瘟，以出血性敗血癥變化為特征。豬是豬瘟病毒的唯一易感動物，本病流行廣，傳染快，死亡率高，一年四季均可發(fā)生。本病自 1833 年在美國俄亥俄州發(fā)現(xiàn)以來，流行世界各地，給養(yǎng)豬業(yè)造成了不同程度的經(jīng)濟損失。要控制豬瘟的流行和發(fā)生，必須強化豬瘟診斷方法的研究，數(shù)十年來，各國學(xué)者的傾力研究，促進了豬瘟診斷方法的的日趨完善和突破，為豬瘟的控制和消滅提供了良好的技術(shù)工具。

1 血清學(xué)診斷方法

豬瘟ELISA試驗是世界動物衛(wèi)生組織推薦的血清抗體檢測方法。Clavijo等利用CSFV E2基因表達產(chǎn)物制成單克隆抗體，建立了競爭ELISA方法，利用此方法對臨床健康豬和試驗感染豬血清2 000份進行檢測。結(jié)果表明其特異性和敏感性分別達到100%和86%，并能在人工感染后21d檢測到抗體。周宗元等[1]應(yīng)用豬瘟兔化弱毒抗原與HRP-SPA建立了HRP-SPA-ELISA方法檢測CSFV抗體。周廣森等[2]應(yīng)用HRP-SPA-ELISA對某豬場40份母豬血清和240份仔豬血清進行檢測，發(fā)現(xiàn)母豬中有10%隱性豬瘟感染者，仔豬中有3.7%的隱性豬瘟感染者，證明了隱性豬瘟的母豬是垂直傳播和水平傳播的傳染源。Shannon等[3]報道抗原捕獲ELISA能夠檢測2種不同株CSFV感染的病豬血液和組織中的抗體。余興龍等[4]以在大腸桿菌中高效表達的CSFV E2基因主要抗原編碼區(qū)（mE2）基因產(chǎn)物為抗原，以HRP標記的兔抗豬IgG為二抗，建立了檢測CSFV抗體的間接ELISA方法，試驗證實用重組mE2蛋白作為診斷豬瘟的抗原，具有特異性高、易純化和成本低等優(yōu)點。Saunder、邱惠深、房德興等分別建立了快速酶標微量技術(shù)、淋巴細胞雜交瘤技術(shù)和單克隆抗體ELISA抑制法等免疫酶測定技術(shù)，這些測定技術(shù)均以豬瘟單克隆抗體為基礎(chǔ)[5-7]。

蘭州所李樹春等[8]進行了豬瘟間接血凝試驗的研究。將豬瘟兔化弱毒株細胞培養(yǎng)物純化后，用醛化綿羊紅細胞致敏，制成間接血凝診斷液，用以檢測血清中的豬瘟抗體效價。該方法具有操作簡單、無需特殊儀器、快速和適于大量樣品的檢測等優(yōu)點，非常適合基層單位的推廣應(yīng)用。

膠體金免疫層析技術(shù)是近幾年國內(nèi)外興起的一種快速診斷技術(shù)，目前分為2類。一類是與儀器配套的自動化免疫分析，另一類是以硝酸纖維素膜為載體的快速免疫分析。金顏輝等[9]應(yīng)用該技術(shù)進行了檢測豬瘟抗體的研究，共測試了30份標準陽性血清和18份標準陰性血清，符合率100%，用該方法進行現(xiàn)場檢測具有直觀、準確、便捷等優(yōu)點。

2 病原學(xué)診斷方法

熒光抗體試驗是Robertso[10]于1965年首次報道的。主要應(yīng)用于豬瘟病料和組織（Flurorescent Antibody，F(xiàn)A）培養(yǎng)物的檢測。主要是用扁桃體、脾、腎、回腸末端等器官制作冰凍組織切片，或?qū)⒉×先閯┙臃N于敏感細胞，培養(yǎng)后也可用FA檢測豬瘟抗原。高免血清的制備是試驗的關(guān)鍵，一般是將豬只免疫6次后提取血液，提純免疫球蛋白，進行熒光素標記。目前已有多家商品化的產(chǎn)品可供選擇。FA方法簡便、快捷、可靠，所以許多國家將其作為執(zhí)行豬瘟撲滅計劃的法定診斷試驗。

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）是以病毒RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄后，再以PCR進行核酸擴增來檢測CSFV的方法。羅廷榮等[11]應(yīng)用RT-PCR對來自廣西不同地區(qū)的135份疑似豬瘟病料進行檢測，陽性率為6.2%。另從柳州地區(qū)采集的健康豬扁桃體和淋巴結(jié)276份，檢測陽性率為13.4%。其中扁桃體檢出陽性率高于淋巴結(jié)檢出陽性率，證實了RT-PCR技術(shù)的臨床診斷方法可行性。劉海鵬等[12]建立了口蹄疫病毒與CSFV的二聯(lián)RT-PCR診斷方法，對2種病毒的敏感性可達到10-4倍稀釋，約10pg的總RNA。證明了該方法對這2種病毒診斷的高度敏感、特異等特點。Liu等報道了用RT-PCR方法檢測感染組織中的CSFV，其敏感性達到10-4TCID50。令人感興趣的是當用巢式RT-PCR進行檢測時，敏感性可提高1 000倍，這對疫病的及時診斷將有更大幫助。Choi等利用巢式RT-PCR對人工接種CSFV的5頭公豬精液進行了檢測，結(jié)果在接種后7d便檢測出了陽性精液。

隨著RT-PCR技術(shù)的日益成熟，實時PCR和熒光定量PCR以其靈敏、快速的優(yōu)點贏得了關(guān)注。Risatti等（2003）應(yīng)用熒光實時RT-PCR對CSFV快速檢測進行了研究，試驗結(jié)果表明該方法的敏感性可以達到甚至超過病毒培養(yǎng)[13]。而在扁桃體和腎中的病毒RNA可以在出現(xiàn)臨床癥狀的前2～4d前檢測出，試驗只需不多于2h的時間。陳玉棟等（2003）建立了快速定量檢測豬瘟兔化弱毒苗的熒光定量PCR技術(shù)[14]。該方法是在兔化弱毒株的5-UTR區(qū)設(shè)計了一對引物和一條熒光探針，利用熒光PCR原理，結(jié)合Light Cycler檢測系統(tǒng)而建立的。結(jié)果表明，該方法靈敏度可達100個拷貝數(shù)，線形范圍為6個數(shù)量級。利用該方法對9份疫苗樣品進行了檢測，與兔體定型熱反應(yīng)方法相比較有很好的相關(guān)性，更重要的是整個檢測只需4h，極大地節(jié)省了時間，為CSF的及時診斷創(chuàng)造了有利條件。

檢測豬瘟病毒抗原最具準確性的是豬瘟病毒的分離鑒定，可采取疑似病豬的淋巴結(jié)或脾臟等組織，研磨后做無菌處理，接種于原代細胞或傳代細胞系進行病毒分離。目前應(yīng)用最廣泛、敏感性最強的傳代細胞系主要有PK-2a（豬腎細胞系）和ST（豬睪丸細胞系）。

3 參考文獻

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