紅豆杉內(nèi)生菌的分離及抗植物病害活性物質(zhì)的初步篩選

鄭法新　程　璐　李　俠　房保?！ⅰ∪骸⒌こ唷±钣癍h(huán)

摘要 以云南紅豆杉的根、莖、葉為材料，從中分離出內(nèi)生菌163株，其中細(xì)菌91株，真菌48株，放線菌24株；以棉花枯萎、小麥赤霉、番茄葉霉等11種病原真菌作為靶標(biāo)菌，研究紅豆杉內(nèi)生菌的抗菌活性，篩選出了有較高抗菌活性的3株內(nèi)生真菌、11株內(nèi)生細(xì)菌和5株內(nèi)生放線菌。

關(guān)鍵詞 紅豆杉；內(nèi)生菌；分離；活性物質(zhì)篩選

中圖分類號(hào) S791.49 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2009）05-0108-02

植物內(nèi)生菌（Plant endophyte）是微生物中的一個(gè)重要類群，能參與植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成與轉(zhuǎn)化或獨(dú)立合成次級(jí)代謝產(chǎn)物，其物種豐富，數(shù)量龐大，已經(jīng)成為新醫(yī)（農(nóng)）藥活性物質(zhì)的潛在資源。研究顯示，目前從植物內(nèi)生菌中分離出的生物活性物質(zhì)，大約51%屬于未報(bào)道過(guò)的新化合物[1]。因此，植物內(nèi)生菌相關(guān)領(lǐng)域的研究工作愈來(lái)愈受到國(guó)內(nèi)外同行的關(guān)注。

近年關(guān)于傳統(tǒng)藥用植物以及特殊生境中植物的內(nèi)生菌研究是一個(gè)新興的研究熱點(diǎn)[2]。云南紅豆杉（Taxus yunnane-nsis Cheng et L.K.Fu）是含有抗癌藥物紫杉醇的藥用植物，屬紅豆杉科喬木，高達(dá) 30m，胸徑可達(dá)lm，產(chǎn)于云南西部至西北部、四川西南部、西藏東部，生于海拔2 000~3 500m高山地帶，國(guó)外緬甸、錫金、不丹也有分布[3，4]。是否能從與紅豆杉共生的內(nèi)生菌或其代謝物中尋找其他新型防治植物病蟲(chóng)害藥物，筆者從紅豆杉中分離的細(xì)菌及真菌，以棉花枯萎、番茄葉霉等植物病害微生物為篩選模型來(lái)篩選紅豆杉內(nèi)生菌產(chǎn)生的抗病活性物質(zhì)進(jìn)行嘗試。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。于2008年9月選擇云南省維西縣塔城鄉(xiāng)天然長(zhǎng)成的成熟健康紅豆杉植株，采集沒(méi)有腐爛發(fā)霉及病斑、病蟲(chóng)害的健康新鮮植物組織備用。

1.1.2 病原菌。棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium sp.Vasinfe-ctum），西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f.niveum Snyder et He-ansen），蘋(píng)果爛病菌（Valsa mali Miyabe et Yamada），玉米彎孢病菌（Curvularia lunata），蘋(píng)果炭疽病菌（Glomerella cingulata），小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis），番茄早疫病菌（Alternaria so-lani），小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum Schw），葡萄炭疽病菌（Glomerella cingulata Spauld），馬鈴薯干腐病菌（Pythium sola-ni），番茄葉霉病菌（Fulria fulva），以上菌株由山東出入境檢驗(yàn)檢疫局房保海工程師饋贈(zèng)。

1.1.3 培養(yǎng)基。分離細(xì)菌所用培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，即瓊脂20g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1 000mL，pH值7.0～7.2。分離真菌以及靶標(biāo)菌的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，即馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1 000 mL。分離放線菌培養(yǎng)基為高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基，即可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，MgSO4 0.5g，F(xiàn)eSO4 0.01g，K2HPO4 0.5g，瓊脂20g，水1 000mL，pH值7.2～7.4。培養(yǎng)基在高壓滅菌后備用，純化培養(yǎng)基與分離培養(yǎng)基組成成分相同。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離。先用自來(lái)水將所采集的紅豆杉植物組織表面沖洗干凈，晾干水分后分別切取根、莖和葉，采用下述方法進(jìn)行表面消毒[5]：0.1%升汞漂洗（10～30s）→無(wú)菌水沖洗數(shù)次→75%酒精漂洗（30～60s）→無(wú)菌水沖洗數(shù)次。在無(wú)菌操作條件下取根、莖和葉，切成0.2cm×0.2cm長(zhǎng)段（片），種植于加青霉素的PDA培養(yǎng)基中，在（28±1）℃條件下置于溫箱靜止培養(yǎng)3～7d。同時(shí)將上述經(jīng)表面滅菌的材料不做任何處理直接種植于加青霉素的PDA培養(yǎng)基中，在（28±1）℃條件下置于溫箱培養(yǎng)，檢查表面消毒是否徹底。

1.2.2 內(nèi)生放線菌和細(xì)菌的分離。將無(wú)菌處理的紅豆杉根、莖、葉樣品各3g，每樣品加10mL 無(wú)菌水碾碎靜置15min后，用無(wú)菌移液槍各取70μL涂在牛肉蛋白胨培養(yǎng)基、高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基平板上，28℃黑暗培養(yǎng)，分離細(xì)菌培養(yǎng)3～5d，分離放線菌培養(yǎng)5～8d。

1.2.3 內(nèi)生菌的純化。對(duì)內(nèi)生真菌，取切口處新長(zhǎng)出的菌絲，及時(shí)轉(zhuǎn)接至新鮮PDA培養(yǎng)基上，對(duì)內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌，待菌落出現(xiàn)后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異以及長(zhǎng)出時(shí)間的不同，分別挑取各平板上的菌落邊緣的細(xì)胞接于新的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)。培養(yǎng)數(shù)日后，觀察菌落的形態(tài)及其菌落邊緣的整齊情況，并做相應(yīng)的記錄。對(duì)菌株編號(hào)后，轉(zhuǎn)至新鮮箱斜面培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7d，然后放入4℃冰箱保存[6]。

1.2.4 拮抗菌活性測(cè)定。拮抗菌活性測(cè)定采用對(duì)峙培養(yǎng)法。在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行無(wú)菌操作：將直徑6mm的供試病原真菌的菌塊接種于PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，再用直徑6mm的打孔器在生長(zhǎng)7d左右的內(nèi)生真菌菌落邊緣制備菌餅，并接種于PDA平板上距中心2cm處同一直線的兩點(diǎn)上，對(duì)照不接篩選菌，28℃下培養(yǎng)72h，測(cè)量各篩選菌菌落邊緣和病原菌菌落邊緣之間的抑菌距離，選擇拮抗作用明顯的菌進(jìn)行復(fù)篩或鑒定[7-9]。該試驗(yàn)重復(fù)2次，每次設(shè)3個(gè)重復(fù)。細(xì)菌和放線菌的抗病原真菌活性篩選采用混澆平板法。用PDA液體培養(yǎng)基28℃下振蕩培養(yǎng)12h，發(fā)酵液10 000 rpm離心10min，取上清液，重復(fù)3次。將1.5mL濾液和15 mL PDA培養(yǎng)基于60℃左右混合均勻倒入培養(yǎng)皿，冷卻凝固后，在每個(gè)培養(yǎng)皿中接入直徑為6mm的供試病原真菌菌塊，28℃下培養(yǎng)4d。以直接培養(yǎng)的病原菌作為對(duì)照[10，11]，發(fā)酵液活性高的菌株將會(huì)抑制病原菌的生長(zhǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅豆杉不同組織部位內(nèi)生菌數(shù)量

對(duì)分離自紅豆杉不同組織部位的內(nèi)生菌數(shù)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，紅豆杉不同組織部位的內(nèi)生菌種類和數(shù)量存有較大的差異，總體上來(lái)說(shuō)，內(nèi)生菌數(shù)量在紅豆杉根中的分布最多，葉子中的內(nèi)生菌數(shù)量最少；同時(shí)，無(wú)論是在根還是在莖和葉中大致的規(guī)律是內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最多，其次是真菌，放線菌數(shù)量最少，也就是細(xì)菌、真菌和放線菌依次呈遞減的趨勢(shì)（見(jiàn)表1）。

2.2 內(nèi)生真菌對(duì)病原真菌的拮抗作用

從紅豆杉的各種組織中分離得到內(nèi)生真菌48個(gè)菌株，通過(guò)對(duì)峙生長(zhǎng)法，測(cè)定了內(nèi)生真菌各菌株對(duì)其中11種病原真菌的皿內(nèi)拮抗作用，結(jié)果表明，其中5株內(nèi)生真菌對(duì)7 種病原真菌有較強(qiáng)的拮抗作用（見(jiàn)表2）。

由表2可以看出，分離得到的內(nèi)生真菌都有不同程度的抑菌作用，其中根和莖中分離的TFR3、TFR5、TFR14、TFS1、TFS14的抑菌作用最強(qiáng)，最為顯著的是TFR5對(duì)蘋(píng)果炭疽的拮抗作用。

2.3 內(nèi)生細(xì)菌、放線菌對(duì)病原真菌的拮抗作用

經(jīng)過(guò)混澆平板法培養(yǎng)4d，觀察并記錄結(jié)果，發(fā)現(xiàn)4株放線菌、8株細(xì)菌的發(fā)酵液都有很高的抑菌活性（見(jiàn)表3、表4）。

有抑菌作用的細(xì)菌占分離得到的內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)的13.75%，真菌占20.83%，放線菌占37.5%。其中TAR1對(duì)小麥紋枯病菌、蘋(píng)果爛病菌、馬鈴薯干腐，TAR11對(duì)小麥紋枯病菌、番茄葉霉病菌、蘋(píng)果爛病菌，TAR13對(duì)小麥紋枯病菌、蘋(píng)果爛病菌，TAS1對(duì)馬鈴薯干腐、葡萄炭疽、番茄早疫，TAS2對(duì)番茄葉霉病菌、西瓜枯萎病菌、蘋(píng)果爛病菌、葡萄炭疽、番茄早疫，TAS5對(duì)番茄早疫，TAS6對(duì)西瓜枯萎病菌、小麥赤霉，TBR1對(duì)玉米彎孢、馬鈴薯干腐，TBR5對(duì)小麥紋枯病菌、番茄葉霉病菌、蘋(píng)果爛病菌，TBR13對(duì)番茄葉霉病菌、蘋(píng)果爛病菌、玉米彎孢、馬鈴薯干腐、番茄早疫，TBR14對(duì)番茄葉霉病菌、西瓜枯萎病菌、蘋(píng)果爛病菌，TBR17對(duì)小麥紋枯病菌、番茄葉霉病菌、蘋(píng)果爛病菌，TBR21對(duì)西瓜枯萎病菌、小麥赤霉，TBR25對(duì)西瓜枯萎病菌，TBR27對(duì)玉米彎孢、馬鈴薯干腐、葡萄炭疽、番茄早疫，TBR36對(duì)番茄葉霉病菌，TBS3對(duì)西瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌都有很強(qiáng)的抑制作用，基本限制了病原體菌絲的生長(zhǎng)與繁殖。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，云南紅豆杉組織內(nèi)存在豐富的內(nèi)生菌，不同組織內(nèi)生菌的數(shù)量、種類有一定差異，在具有抑菌活性的菌物中，放線菌占的比例最高。另外，由于細(xì)菌也能產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，因此可作為對(duì)多種病原菌具有抑菌活性物質(zhì)篩選的資源。

目前，植物內(nèi)生菌分離方法大多數(shù)采用常規(guī)表面消毒法，本試驗(yàn)對(duì)此方法進(jìn)行了改進(jìn)，先用消毒效果更好的0.1%升汞漂洗10～30s進(jìn)行消毒。為確保所分離到的微生物為植物體內(nèi)生菌，采用的表面消毒比一般組織培養(yǎng)消毒更為嚴(yán)格，并對(duì)所消毒材料沖洗后的第4次無(wú)菌水進(jìn)行涂板培養(yǎng)，如在2～3d內(nèi)沒(méi)有菌落產(chǎn)生，則認(rèn)為該材料消毒徹底，證明所分離到的為內(nèi)生菌。但用此消毒方法也易于殺死植物體內(nèi)微生物，因而所分離到的內(nèi)生菌種類與數(shù)量可能比植物體內(nèi)所含的要少些。

在進(jìn)行內(nèi)生菌分離的過(guò)程中，掌握適宜的材料消毒時(shí)間對(duì)最終分離到的內(nèi)生菌的數(shù)量和種類都具有極其重要的作用。另外，所用培養(yǎng)基均為常規(guī)分離用的培養(yǎng)基，因而不能保證所有生活在紅豆杉組織內(nèi)的微生物能夠全被分離出來(lái)，可能有的稀有微生物不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。所選用的材料為天然生長(zhǎng)70年左右的紅豆杉樹(shù)，所以不能確定生長(zhǎng)期更長(zhǎng)的紅豆杉材料中內(nèi)生菌數(shù)量和種類是否更多，產(chǎn)出的活性物質(zhì)是否更強(qiáng)，這有待進(jìn)一步探索和研究。試驗(yàn)選用的測(cè)試菌種也是從本實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)選取的，不能測(cè)出內(nèi)生菌對(duì)所有病原菌的抑制作用，只是做了初篩，為進(jìn)一步復(fù)篩奠定了基礎(chǔ)。內(nèi)生菌系統(tǒng)地分布于植物體根、莖、葉、花、果實(shí)和種子等器官、組織的細(xì)胞或細(xì)胞間隙。近年來(lái)，已從宿主植物的根、莖、葉及儲(chǔ)藏器官內(nèi)分離到大量?jī)?nèi)生細(xì)菌。本試驗(yàn)從根、莖中分離出細(xì)菌和真菌數(shù)量較多，從葉中分離出少量?jī)?nèi)生真菌，與文獻(xiàn)報(bào)道的葉片內(nèi)生真菌分布比較少的結(jié)論類似；從根中分離出較多量?jī)?nèi)生真菌的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的不同。

4 參考文獻(xiàn)

[1] STROBELG A.Endophytes as sources of bioactive products[J].Microbes and Infection，2003（5）：535-544.

[2] FR?魻HLICH J，HYDE KD.Palm Microfungi，F(xiàn)ungal Diversity Research Series：3.Fungal[M]. Hong Kong：Diversity Press，2000.

[3] WANI M C，TAYLOR H I，WALL M E，et al.Plant antitumor agents IV The isolation and structure of taxol，a novel anti-leukemic and antitumor agent from Taxus brevffolia[J]. J Am Chem Soc，1971，93（9）：23-25.

[4] SCHIFF P B，F(xiàn)ANT J，HORWITZ S B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol[J].Nature，1979，277（5698）：665-667.

[5] 邵士成，吳少華，陳有為，等.云南元江印楝植物內(nèi)生真菌的種類組成[J].生物多樣性，2008，16（1）：63-67.

[6] 郭建新，孫廣宇，張榮，等.銀杏內(nèi)生真菌抗真菌活性菌株的分離和篩選[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，14（40）：14-17.

[7] 田小曼，吳云鋒，張玨.青蒿內(nèi)生菌的分離及抗病活性物質(zhì)的篩選[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（4）：186-190.

[8] 王美琴，陳俊美，薛麗，等.番茄內(nèi)生細(xì)菌的分離及拮抗菌的篩選[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（2）：55-58.

[9] 袁秀英，白紅霞，白玉明，等.楊樹(shù)內(nèi)生真菌的分離和拮抗生防菌的篩選[J].林業(yè)科學(xué)研究，2006，19（6）：713-717.

[10] 李萌，張海濤，虞星炬，等.蔬菜內(nèi)生菌的分離及其生防功能初探[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（5）：60-65.

[11] 陳風(fēng)美，孫勇，蔣繼宏，等.植物內(nèi)生真菌抑制細(xì)菌活性菌株的篩選[J].腐植酸，2003（6）：15-18.