作物抗旱基因工程研究進(jìn)展

陳建中　葛水蓮　李　磊

摘要：主要就植物的抗旱基因包括滲透調(diào)節(jié)、保護(hù)酶體系、抗旱基因及遺傳特性等方面對(duì)植物抗旱機(jī)理的研究進(jìn)行了綜述。研究植物的抗旱性基因，有助于了解植物的抗旱機(jī)制，以期為我國(guó)節(jié)水抗旱農(nóng)業(yè)的研究提供一些新的思路和手段。

關(guān)鍵詞：作物；抗旱機(jī)理；水分脅迫；基因工程

中圖分類號(hào)：S332.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114(2009)02-0475-03

干旱已是世界性的問(wèn)題，世界干旱，半干旱地區(qū)已占陸地面積的1/3以上，干旱對(duì)植物的影響在諸多自然逆境因素中占首位。國(guó)外已經(jīng)開始有轉(zhuǎn)抗旱基因植物的研究，已有數(shù)十種植物被轉(zhuǎn)化獲得了抗旱轉(zhuǎn)基因植株，并已在水稻上成功地進(jìn)行了轉(zhuǎn)抗旱基因水稻品系的培育。本文對(duì)上述幾方面的研究進(jìn)行了綜述，旨在總結(jié)植物抗旱的新機(jī)制，以利于更好的進(jìn)行抗旱工作。

1滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)旱害的調(diào)控

1．1植物體內(nèi)脯氨酸的合成

1．1．1脯氨酸合成酶研究現(xiàn)狀編碼脯氨酸合成酶基因的研究較為深入，至今已從水稻、黑麥、綠豆、大豆、擬南芥、蒺藜、苜蓿、榆錢、菠菜等植物中克隆出了多個(gè)與脯氨酸合成酶相關(guān)的基因，其中包括P5CS、PSCR、OAT和Pro。鳥氨酸循環(huán)中6～OAT基因已在大豆、苜蓿、擬南芥等中得到克隆。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ProT基因在擬南芥、番茄、水稻、大麥等中得到克隆。WU研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中P5CS是由2個(gè)不同調(diào)節(jié)基因編碼的。該基因有19個(gè)內(nèi)含子和20個(gè)外顯子定位于2號(hào)染色體78.5位置上的AtP5CSl基因可以在大多數(shù)植物器官中表達(dá)，但在分裂細(xì)胞中沉默：定位于3號(hào)染色體101.3位置上的AtP5CS2基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，占植物組織中P5CSm-RNA總量的20～40％，并在分裂細(xì)胞中負(fù)責(zé)合成P5CSutRNA，AtPSCS轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累具有組織特異性。同樣在番茄的核基因組中，也發(fā)現(xiàn)有2個(gè)脯氨酸基因座(10ci)：一個(gè)是特異性雙功能tom Pro2基因座：另一個(gè)基因座為torn Pro1，該基因座編碼一個(gè)多順?lè)醋觤RNA，指導(dǎo)7-GK和GSADH 2種多肽的合成。P5CS基因廣泛存在于單子葉和雙子葉植物中；P5CR基因有7個(gè)外顯子，6個(gè)內(nèi)含子，其位于擬南芥的5號(hào)染色體上：6-OAT基因有10個(gè)外顯子，9個(gè)內(nèi)含子，該基因定位于擬南芥的5號(hào)染色體上：脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因有8個(gè)外顯子，7個(gè)內(nèi)含子，該基因定位于水稻的3號(hào)染色體上，在擬南芥中脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是2個(gè)不同調(diào)節(jié)基因編碼的，該基因有7個(gè)內(nèi)含子6個(gè)外顯子，定位于2、3號(hào)染色體上。

1．1．2脯氨酸在轉(zhuǎn)基因植物中的表現(xiàn)將PSCS和6-OAT分別轉(zhuǎn)入煙草植株中發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotianatabacum)中脯氨酸含量明顯提高且與對(duì)照相比，耐鹽性也有所提高，轉(zhuǎn)入其他植物也得到同樣的結(jié)論。將從烏頭葉豇豆中克隆的P5CS基因與CoMV35S啟動(dòng)子連接后轉(zhuǎn)人煙草中。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量比對(duì)照高10～18倍。在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草落葉少且遲。將擬南芥的6-OAT基因?qū)藷煵荩垢彼崂鄯e增加2倍，轉(zhuǎn)基因的幼苗可在200mmol·LNaCl中正常生長(zhǎng)：將此基因?qū)藷煵荩垢彼崂鄯e增加2倍，轉(zhuǎn)基因的幼苗可在200mmol·L^-1NaCl中正常生長(zhǎng)。楊成民從豇豆中分離到的P5CS為目的基因，通過(guò)基因槍與選擇標(biāo)記bar基因共轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因黑麥草再生植株，Kishor等將P5CS基因?qū)藷煵?，轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸含量比對(duì)照高10～18倍：在鹽脅迫條件下，與對(duì)照相比轉(zhuǎn)基因植株根的長(zhǎng)度和干重增加，植株生物產(chǎn)量提高花發(fā)育得更好，果莢數(shù)目和每莢的種子數(shù)也增加，李燕等在皂角苗木對(duì)干旱脅迫的生理生化反應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，皂角的脯氨酸含量先增后減，Bajin等發(fā)現(xiàn)濱藜中脯氨酸含量的增加在葉中較顯著，對(duì)根沒(méi)有顯著影響。也有研究發(fā)現(xiàn)，根的脯氨酸增加的幅度比莖葉中都大。

1．2其他調(diào)節(jié)物質(zhì)

1．2．1果聚糖合成酶基因有證據(jù)表明被子植物演化過(guò)程中果聚糖積累與一些植物耐旱(寒)能力相關(guān)，其中果聚糖蔗糖酶基因soeB)是較早克隆的基因。張慧等1998年將ssacB轉(zhuǎn)入煙草，經(jīng)卡那霉素篩選的抗性芽能在含1％NaCl的MS培養(yǎng)基上正常生根，而未轉(zhuǎn)化的芽則不能生根或根生長(zhǎng)緩慢。轉(zhuǎn)基因小苗移栽后用含1％NaCl的營(yíng)養(yǎng)液澆灌17d后，一些轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)良好，而未轉(zhuǎn)化苗出現(xiàn)明顯萎蔫，表明sacB基因能提高煙草的耐鹽性。

1．2．2甜菜堿合成有關(guān)的酶基因甜菜堿是一種重要的植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，特別是藜科和禾本科植物，在受到水分脅迫時(shí)積累大量甜菜堿。甜菜堿在植物中以膽堿為底物經(jīng)兩步合成，即膽堿加單氧酶(CMO)催化膽堿氧化成甜菜堿醛，然后，甜菜堿醛脫氫酶(BADH)催化甜菜堿醛形成甜菜堿。

1．2．3甘露醇合成的相關(guān)基因植物抗性生理研究結(jié)果證實(shí)，糖醇與植物的抗旱耐鹽能力有關(guān)，甘露醇是生物體內(nèi)包含細(xì)菌、藻類、真菌和100多種高等植物中廣泛分布的一種糖醇，在甘露醇合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用的酶，在細(xì)菌中是甘露醇-1-磷酸脫氫酶，其編碼基因?yàn)閙tlD。

2保護(hù)酶體系

保護(hù)酶體系包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ASP)等。SOD可分為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD 3種類型，Cu-SOD主要在葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中，Mn-SOD主要存在于線粒體中，F(xiàn)e-SOD則主要存在于葉綠體中，將煙草的Mn-SODcDNA導(dǎo)人苜蓿后，轉(zhuǎn)基因苜蓿的抗旱性得到了提高，將Mn-SOD基因定位到煙草的葉綠體和線粒體上，發(fā)現(xiàn)也能表達(dá)其基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在葉綠體中Mn-SOD的過(guò)量表達(dá)使煙草受干旱所引起的氧化傷害程度比對(duì)照明顯減輕，但線粒體中增加的Mn-SOD活性對(duì)煙草耐氧化脅迫能力沒(méi)多大影響，另外，表達(dá)擬南芥Fe-SOD的轉(zhuǎn)基因煙草、表達(dá)番茄Cu/Zn-SOD的轉(zhuǎn)基因煙草、過(guò)量表達(dá)豌豆Cu/Zn-SOD的轉(zhuǎn)基因煙草均能增強(qiáng)抵抗干旱引起的氧化脅迫能力。

3植物抗旱基因與遺傳

3．1保護(hù)生物大分子及膜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)

3．1．1水通道蛋白(aquapofin)水通道蛋白是指作為跨膜通道的主嵌入蛋白(MIP)家族中具有運(yùn)輸水分功能的一類蛋白質(zhì)，能夠促進(jìn)和調(diào)節(jié)水分跨膜的被動(dòng)交換，包括植物體內(nèi)的跨細(xì)胞和胞內(nèi)水分流動(dòng)，是水分跨膜運(yùn)輸?shù)闹匾緩街弧?/p>

3．1．2調(diào)滲蛋白在高鹽濃度下，培養(yǎng)的煙草細(xì)胞中多種蛋白質(zhì)的含量發(fā)生了變化。其中一種分子量為26KD的蛋白質(zhì)的增加尤為顯著，高達(dá)細(xì)胞總蛋白量的12％以上。該蛋白的積累則要求氯化鈉或低

水勢(shì)的存在。除煙草外其他一些植物西紅柿、馬鈴薯、胡蘿卜、棉花、小米和大豆的培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)ABA處理后也出現(xiàn)了同OSM起免疫交叉反應(yīng)且分子量約為26KD的蛋白質(zhì)。這表明OSM可能是一種普遍存在于高等植物的蛋白質(zhì)。目前已得到由農(nóng)桿菌介導(dǎo)將OSM的啟動(dòng)子和B-葡萄糖苷醛酶(GUS)報(bào)告基因嵌合在一起的轉(zhuǎn)基因煙草。

3．1．3胚胎后期發(fā)生豐富蛋白(LEA蛋白)在種子后期發(fā)育過(guò)程當(dāng)中，LEA蛋白隨種子的脫水成熟其含量增加。在脅迫條件下LEA蛋白在植物細(xì)胞中起保護(hù)作用，這種保護(hù)作用對(duì)于植物在極端壓力條件下是必要的。根據(jù)LEA的結(jié)構(gòu)推測(cè)LEA蛋白可能有以下三方面的作用：①作為脫水保護(hù)劑，由于LEA蛋白在結(jié)構(gòu)上富含不帶電荷的親水氨基酸，它們既能像脯氨酸那樣，通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)的其他蛋白發(fā)生相互作用，使其結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，又可能給細(xì)胞內(nèi)的束縛水提供了一個(gè)結(jié)合的襯質(zhì)，從而使細(xì)胞結(jié)構(gòu)在脫水中不致遭受更大的破壞。②作為一種調(diào)節(jié)蛋白而參與植物滲透調(diào)節(jié)。③通過(guò)與核酸結(jié)合而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)其它基因的表達(dá)。

3．2編碼抗旱轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)基因

DREB是目前研究較多的抗非生物脅迫的轉(zhuǎn)錄因子。Xiong利用差示顯示法從干旱處理的擬南芥中克隆了一批受干旱誘導(dǎo)的rd基因，對(duì)rd29A基因啟動(dòng)子進(jìn)行分析揭示了一個(gè)與干旱、高鹽及低溫脅迫應(yīng)答基因有關(guān)的DRE順式作用元件，并克隆了3個(gè)與DRE元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，用干旱或高鹽處理10min，DREB2A和DREB2B被快速?gòu)?qiáng)烈誘導(dǎo)，并且不受外源ABA的誘導(dǎo)。Hara利用CaMV35S啟動(dòng)子和逆境誘導(dǎo)特異啟動(dòng)子rd29A，將DREBIA的cDNA導(dǎo)入擬南芥，DREBlA的過(guò)量表達(dá)激活許多耐逆境功能基因的表達(dá)如rd29A、Kinl、Con5a、Cor6和P5CS等轉(zhuǎn)基因植株耐旱性、耐鹽性和耐凍性提高。

4展望

我國(guó)北方地區(qū)土壤干旱、鹽漬化是影響農(nóng)牧生產(chǎn)的重要因素。通過(guò)篩選與植物的抗旱性、抗鹽堿性相關(guān)的基因，研究其功能，揭示其相關(guān)因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，采用現(xiàn)代生物技術(shù)手段進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種、獲得耐旱和耐鹽堿能力強(qiáng)的新品種已成為解決我國(guó)中西部干旱、半干旱地區(qū)農(nóng)牧業(yè)發(fā)展種質(zhì)資源矛盾的有效手段之一。

4．1目前利用基因工程技術(shù)培育抗旱品種主要有兩種策略

1、增加植物滲透性代謝產(chǎn)物的合成能力，使植物在水分脅迫下能合成更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸，甘露醇、甜菜堿、海藻糖等，以提高植物的滲透調(diào)節(jié)能力，從而增強(qiáng)植物的抗旱性。

2)增強(qiáng)植物對(duì)活性氧自由基的清除能力，使植物在水分脅迫下過(guò)量表達(dá)一些酶(如SOD，POD，CAT等)，以有效地排除有害的活性氧自由基，從而提高細(xì)胞耐脫水的能力。

4．2在通過(guò)基因工程方法進(jìn)行抗旱分子育種的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)存在一些問(wèn)題

由于人們對(duì)植物抗旱的分子機(jī)制缺乏了解，抗旱分子育種還有很大的盲目性：采用單基因策略提高植物的抗旱性對(duì)有的基因和植物有效，對(duì)有的基因和植物卻無(wú)效：利用35S啟動(dòng)子與抗旱基因組合在提高植物抗旱性的同時(shí)也造成植物畸形發(fā)育；外源基因表達(dá)水平不穩(wěn)定。盡管目前抗旱分子育種面臨不少的問(wèn)題，但隨著抗旱分子生物學(xué)研究的深人和生物技術(shù)的進(jìn)步，相信不久的將來(lái)會(huì)有大量的抗旱基因作物應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中來(lái)。

(責(zé)任編輯昌炎新)