毛冬青中三萜皂苷類化合物的NMR歸屬*

張翠仙，楊金燕，林朝展，趙鐘祥，馮育林，曾隴梅，祝晨蔯

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州510006；2.江西中醫(yī)學(xué)院中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，江西 南昌330006；3. 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州510275)

毛冬青為冬青科(Aquifoliacae)冬青屬(IlexL.)植物毛冬青IlexpubescensHook. Et. Arn.的干燥根，是我國(guó)嶺南地區(qū)習(xí)用中藥。具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒之功效，臨床上廣泛應(yīng)用于治療冠心病、心絞痛和脈管炎等疾病，療效確切[1-2]。前期藥理活性研究表明毛冬青總?cè)圃碥站哂忻黠@降低血漿粘度的作用。在此指導(dǎo)下，對(duì)其乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位的化學(xué)成分進(jìn)行深入研究，經(jīng)理化性質(zhì)及波譜方法鑒定，并與文獻(xiàn)對(duì)照[3-4]，確定其結(jié)構(gòu)分別為ilexsaponin B1(1)和ilexsaponin B2(2)(圖1)。本文首次采用2D二維NMR技術(shù)對(duì)分離得到兩個(gè)三萜皂苷的NMR信號(hào)進(jìn)行歸屬。

圖1 化合物1和2的結(jié)構(gòu)圖

1 結(jié)果與討論

化合物1，白色針晶，θmp246～247 ℃。Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽(yáng)性。FAB-MS，m/z799 [M+H]+，結(jié)合1H NMR、13C NMR及DEPT譜(表1，7個(gè)甲基、11個(gè)亞甲基、15個(gè)次甲基和8個(gè)季碳)確定分子式為C41H66O15，不飽和度為9。NMR顯示1具有1個(gè)孤立羧羰基[δC180.7(s)]，1個(gè)雙鍵[δC128.1(d), 139.9(s)和δH5.65(br s，1H)]，除此外無(wú)任何其他不飽和信息，暗示1為五環(huán)三萜皂苷類化合物。NMR還顯示該化合物結(jié)構(gòu)中具有2個(gè)連氧亞甲基[δC66.7(t), 62.6(t), δH3.70(m, 1H), 4.31(m, 1H), 4.45(m, 1H), 4.52(m, 1H) ]8個(gè)連氧次甲基[δC88.8 (d), 83.1(d)，78.3(d), 71.5(d), 77.0(d), 78.0(d), 70.9(d), 77.9 (d)；δH3.25(dd, 2H, 11.2, 4.0), 4.50 (m,1H) 3.93 (m, 1H) 4.37 (m, 1H), 4.12 (m1H), 4.25 (m, 1H), 4.17 (m, 1H), 4.29 (m, 1H)]和1個(gè)連氧季碳[δC73.4(s) ]。HPLC-ESI-MSn給出m/z821 [M+Na]+，659 [M+Na-162]+，527 [M+Na-162-132]+暗示化合物1可能含有1個(gè)分子葡萄糖和1個(gè)分子木糖。同時(shí)1H NMR數(shù)據(jù)顯示有兩個(gè)端基質(zhì)子信號(hào)δH4.84 (d, 1H,J=5.2 Hz)和δH5.38 (d, 1H,J=7.6 Hz)(圖2)，表明1為二糖五環(huán)三萜皂苷。

圖2 化合物1，2的1H-1HCOSY和主要HMBC相關(guān)

將化合物1進(jìn)行酸水解[4]，糖的GLC分析結(jié)果表明(表2，3)，兩個(gè)糖分別為D-木糖和D-葡萄糖。HMBC中δH4.84 (H-1′)與δC88.8(C-3)，δH5.38 (H″-1)與δC83.1 (C′-2)之間的相關(guān)，表明該糖鏈與苷元的C-3位相連，二糖之間1→2 (Glc 1→2 Xyl-)連接。將1的1H和13C NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[3-4]對(duì)照一致，確定其為ilexsaponin B1。

表1 化合物1，2苷元的13C NMR 數(shù)據(jù)

表2 化合物1,2苷元的1H NMR數(shù)據(jù) (δH， J/ Hz)1)

表3 化合物1，2糖基部分NMR數(shù)據(jù)1)

化合物2，白色針晶，θmp240～241 ℃。Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽(yáng)性。FAB-MS，m/z945 [M+H]+，結(jié)合1H NMR、13C NMR及DEPT譜(8個(gè)甲基、11個(gè)亞甲基、20個(gè)次甲基和8個(gè)季碳)確定其分子式為C47H76O19，不飽和度為10。1H NMR譜數(shù)據(jù)顯示有三個(gè)端基質(zhì)子信號(hào)δH4.91(d, 1H,J=6.8 Hz)，5.82(d, 1H,J=7.5 Hz)，6.42(br s, 1H)。HPLC-ESI-MSn給出m/z967 [M+Na]+，821 [M+Na-146]+，659 [M+ Na -146-162]+，527 [M+ Na -146-162-132]+，表明該化合物為三糖五環(huán)三萜皂苷。比較2和1的NMR數(shù)據(jù)，二者數(shù)據(jù)相似，只是2又多了一個(gè)甲基五碳糖基信號(hào)[δH6.42(br s,1H), 4.78(m,1H), 4.70(m,1H), 4.34(m,1H), 5.02(m,1H), 1.80(6.0, d, 3H)和δC102.1(d), 72.4(d), 72.6(d), 74.4(d), 69.6(d), 19.0(q)]。

同樣將2進(jìn)行酸水解[4]，糖的GLC分析結(jié)果表明D-木糖、D-葡萄糖和L-鼠李糖存在。HMBC中δH4.91(H-1′)與δC89.6(C-3)、δH5.82(H″-1)與δC79.1(C′-2)及δH6.42 (H-1″′)與δC79.5 (C″-2)之間的相關(guān)關(guān)系，證實(shí)此三糖連接順序?yàn)?→2(Rha 1→2 Glc1→2 Xyl -)連接，并且位于苷元的C-3位。將2的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4-5]對(duì)照一致，確定其為ilexsaponin B2。

藥理活性研究表明：毛冬青總皂苷明顯降低小鼠血漿黏度，說(shuō)明具有很好的心腦血管疾病的應(yīng)用前景。同時(shí)體外生理活性試驗(yàn)研究表明，三萜類化合物具有抗寄生蟲活性和溶血活性。而且具有28位游離羧基的五環(huán)烏蘇烷型三萜類化合物具有很好的抑制錐體蟲活性[7]。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑及藥材

北京泰克光學(xué)儀器廠X-6型熔點(diǎn)儀；英國(guó)VG公司ZAB-HS雙聚焦磁質(zhì)譜儀；美國(guó)Finnigan公司LCQDECAXP高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀；瑞士Bruker公司 AVANCE AV 400超導(dǎo)核磁共振儀。層析硅膠(200～300目)為青島海洋化工廠產(chǎn)品；溶劑和試劑均為廣州化學(xué)試劑廠分析純。

實(shí)驗(yàn)藥材購(gòu)自廣州致信中藥飲片有限公司，經(jīng)祝晨蔯研究員鑒定為冬青科植物毛冬青IlexpubescensHook. Et. Arn.的干燥根，樣品保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥質(zhì)量分析研究室(編號(hào)MDQ2001-1)。

2.2 提取與分離

毛冬青根(10 kg)，粉碎，用30 Lφ=30%乙醇，于室溫下浸提5次。將提取液合并，減壓濃縮得棕褐色黏稠膏狀物(1.6 kg)。浸膏加水分散后依次用乙酸乙酯、正丁醇分配萃取，萃取液減壓濃縮，乙酸乙酯部位得到棕褐色浸膏(396 g)。將乙酸乙酯部位用硅膠(200～300目)柱減壓柱層析，洗脫劑采用逐漸增大極性的石油醚-乙酸乙酯體系、乙酸乙酯-甲醇體系洗脫。石油醚-乙酸乙酯(體積比為0∶100)洗脫劑洗脫得化合物1(2.7 g)；乙酸乙酯-甲醇(體積比為80∶20)洗脫劑洗脫得化合物2(1.8 g)。

2.3 化合物1和2的酸水解

化合物(1和2各5 mg)用φ=9% HCl水溶液在90 ℃條件下水解5 h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻。反應(yīng)液冷凍干燥，用吡啶溶解，添加氯化L-半胱氨酸甲基酯，在60 ℃條件下硅醚化，反應(yīng)液離心后取上清液用GLC檢測(cè)。

2.4 化合物的物理常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)

ilexsaponin B1(1)，白色針晶，θmp246～247℃。FAB-MS，m/z799 [M+H]+，HPLC-ESI-MSnm/z821 [M+Na]+，659 [M+Na-glc]+，527 [M+Na-glc-xyl]+;1H NMR 和13C NMR (D6-pyridine) 見(jiàn)表1, 2和3。

ilexsaponin B2(2)，白色針晶，θmp240～241 ℃。FAB-MSm/z945 [M+H]+，927 [M+H- H2O]+; HPLC-ESI-MSn,m/z967 [M+Na]+，821 [M+Na-rha]+，659 [M+ Na -rha-glc]+，527 [M+ Na -rha-glc-xyl]+;1H NMR和13C NMR (D6-pyridine) 見(jiàn)表1, 2和3。

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