犬胰島細(xì)胞分離純化實(shí)驗(yàn)研究

賀長(zhǎng)軍

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物的選擇:選用成年犬22只,體重約20～30 kg,雌雄不限,由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)外科提供。

1.1.2主要試劑:Ficoll胰腺灌注液(HC-A),膠原酶V,胎牛血清(FBS),二苯硫卡巴腙(DTZ),吖啶橙(Acridine Orange,AO),碘化丙啶(Propidium Iodide,PI),分散酶Liberase RPMI,稀釋溶液M199,沖洗溶液CMRL,終沖洗液/培養(yǎng)基,人血白蛋白,DNase I酶,HEPES,HBSS,胰島素放射免疫試劑盒。1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 犬胰腺的獲取以及運(yùn)輸:在全麻下剖腹,打開腹腔,在胰腺周圍撒入冰屑,于腎動(dòng)脈開口下方之腹主動(dòng)脈上系兩跟細(xì)線,遠(yuǎn)端結(jié)扎,在近端側(cè)用剪刀剪一小口,插入灌注管,在膈肌上方將胸主動(dòng)脈結(jié)扎,用冷的HC-A快速灌注,用量約為1 500毫升,同時(shí)打開下腔靜脈,排出血液。觀察腹腔各器官,當(dāng)顏色呈均勻灰白色,靜脈流出液清亮而不帶血色時(shí),表示灌注成功。待胰腺灌注完成后,連同十二指腸一并將胰腺切下,放入周圍有冰屑的胰腺容器中,運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 犬胰腺的初剪以及灌注:在超凈臺(tái)內(nèi)將胰腺?gòu)臒o(wú)菌的胰腺容器中取出,抽取2毫升保存液進(jìn)行微生物檢測(cè)。放入預(yù)先倒入Hanks平衡液的初剪盤上,初剪盤置于冰屑上。

切除十二指腸及較多脂肪和筋膜組織,進(jìn)行初剪。同時(shí)注意胰腺的大小,有無(wú)損傷,灌注的效果如何。第1個(gè)燒杯中倒入10% betadine溶液,第2個(gè)倒入二性霉素B溶液,第3個(gè)倒入冷的HBSS液各500ml。將修剪的胰腺放入第1個(gè)燒杯,清洗并控出多余液體,然后浸入第2個(gè)燒杯,最后在第3個(gè)燒杯中清洗。將胰腺放入稱重瓶中進(jìn)行稱重并計(jì)數(shù),移入另一超凈臺(tái)中進(jìn)行灌注。

在制冷的循環(huán)剪切盤上進(jìn)行灌注,冷循環(huán)剪切盤中加入冷的Euro Collins (100 ml)。在膽總管附近胰頭后方找到主副胰管,插入套管針,縫扎系緊固定,經(jīng)套管打入U(xiǎn)W液少許,使主副胰管膨脹,從而證實(shí)犬胰腺兩葉插管成功。抽取2毫升液Euro Collins進(jìn)行生物學(xué)檢測(cè) 。

將插管的胰腺放在灌注罐的篩網(wǎng)上,連接外部管線到前面的端口。將liberase膠原酶溶液倒入灌注盤中,排除管線中的空氣。用4 ℃的liberase膠原酶循環(huán)灌注,依靠蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)速來(lái)調(diào)節(jié)膠原酶的灌注壓力。在80毫米汞柱灌注壓力下維持5分鐘,在180毫米灌注壓力下維持5分鐘,灌注同時(shí)修剪胰腺,剔除包膜。如果有滲漏應(yīng)予鉗夾,保持灌注壓力的的恒定,將灌注好的胰腺放入腎盤中,回收膠原酶,并將胰腺剪成數(shù)個(gè)2～3厘米的小塊,移入另一超凈臺(tái)的Ricordi chamber(震蕩室)中進(jìn)行消化。同時(shí)抽取1毫升膠原酶進(jìn)行生物學(xué)檢測(cè)。

1.2.3 犬胰腺的消化:在進(jìn)行消化之前,將剪碎的胰腺連同收集剩余的膠原酶溶液一起加入到震蕩室內(nèi),封閉系統(tǒng),進(jìn)行循環(huán),排除氣泡。在消化8～10分鐘時(shí)開始,每隔2～3分鐘抽取樣品1 ml,并加入2～3 ml DTZ。記錄觀察結(jié)果直到游離胰島可見。當(dāng)樣品中可見50%游離胰島以及較多細(xì)小組織碎片時(shí),開始加入稀釋液以終止酶的消化過(guò)程。將泵的速度調(diào)至300 ml/min。繼續(xù)加入稀釋液8 L。收集消化的組織放于250 ml冷循環(huán)錐形試管架中的錐形試管中。每個(gè)試管加入人血清15 ml,加入85 ml MEM于前6個(gè)試管中,當(dāng)試管加滿后,立即放于冰屑中保存以快速冷卻。在4 ℃下將錐形離心管以1 000 rpm離心1分鐘。將上清夜中表層200 ml吸出,然后加入冷的M199洗液將胰島沉淀重新懸浮。然后重復(fù)上述過(guò)程,直到所有消化下來(lái)的組織全部收集于1～2個(gè)250 ml離心瓶中。在純化前從250 ml含M199的離心瓶中抽取100 μl樣品用于生物學(xué)檢測(cè)。將離心瓶于1 000 rpm下離心,然后盡量去除沉淀表面的上清液,重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞沉淀的體積和重量,然后將細(xì)胞沉淀重新懸浮于100 ml UW液中。然后在COBE 2991機(jī)器中用Ficoll純化梯度純化樣品。

1.2.4 犬胰島的純化:將Ficoll(1.100,130 mL)倒入第1個(gè)燒杯,將蠕動(dòng)泵速調(diào)至最大(50 mL/min)使其快速進(jìn)入COBE。當(dāng)所有Ficoll進(jìn)入COBE時(shí),關(guān)閉蠕動(dòng)泵,重新夾閉管線,并連接到泵上,將Ficoll(1.100,130 ml)倒入前一個(gè)燒杯。打開兩個(gè)燒杯之間的夾子以使足夠的Ficoll流入到兩杯連線之間,重新夾閉。將Ficoll(1.077,140 ml) 倒入第2個(gè)燒杯中,徹底打開兩個(gè)燒杯之間的夾子磁力攪拌器讓兩種Ficoll液相混合。當(dāng)所有Ficoll液將要全部流入管線時(shí),傾斜燒杯,并加入100 ml UW/胰島制劑,最后加入M199(50 ml)以沖洗UW/胰島制劑。當(dāng)所有沖洗液經(jīng)過(guò)管線進(jìn)入COBE時(shí),關(guān)閉蠕動(dòng)泵,然后緩慢打開夾子以釋放COBE內(nèi)的壓力,計(jì)時(shí)5分鐘。

收集時(shí)將其分別收集到6個(gè)試管中,第1試管主要是胰腺組織,第2個(gè)試管為胰腺組織和少量的胰島,第3、4個(gè)試管內(nèi)為胰島細(xì)胞,第5、6個(gè)試管內(nèi)為廢棄物。從每一個(gè)試管中取出1 ml加入到標(biāo)記的六孔板中(×2),并加入二苯硫卡巴腙2～3 mL。記錄純度。

2結(jié)果

我們共進(jìn)行了22例犬胰島的分離和純化的研究,熱缺血時(shí)間為(5±2)分鐘,冷缺血時(shí)間為(3±0.5)小時(shí)。犬胰腺的重量為(32.3±10.3)克,胰腺的插管后灌注時(shí)間為(10±3)分鐘,消化時(shí)間為(25±6)分鐘,消化前胰島計(jì)數(shù)平均為(155 040±310)IEQ/胰腺,純化后的胰島平均計(jì)數(shù)為(74 200±185)IEQ/胰腺。本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,顯著性檢驗(yàn)采用2樣本均數(shù)差別的t檢驗(yàn)。

3討論

糖尿病是常見的內(nèi)分泌代謝性疾病,嚴(yán)重危害人們身心健康。胰島移植是臨床替代外源性胰島素治療1型糖尿病最有效的方法。研究證明,胰島移植不僅能糾正糖尿病患者的糖代謝異常,更重要的是可以防治糖尿病微血管病變的發(fā)生發(fā)展,但胰島移植發(fā)展必然要經(jīng)歷實(shí)驗(yàn)研究和臨床實(shí)踐兩個(gè)階段,在胰島移植中,如何獲得足夠數(shù)量、具有高純度和活性的胰島細(xì)胞是一個(gè)重要而復(fù)雜的環(huán)節(jié),其成敗直接關(guān)系到所分離純化的胰島細(xì)胞可否用于臨床及移植后能否糾正糖尿病。我們連續(xù)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分離和純化了22例犬胰腺,使分離和純化出來(lái)的胰島細(xì)胞無(wú)論在數(shù)量上還是在質(zhì)量上都能夠滿足臨床移植的需要。

(收稿日期2009-11-01)