心肌肌鈣蛋白I檢測(cè)方法的分析和進(jìn)展

袁文華

眾所周知,心血管疾病是威脅人類健康與生命的頭號(hào)殺手,高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率及較高的治療費(fèi)用已使其成為阻礙社會(huì)發(fā)展的一大障礙。急性心肌梗死(AMI)是冠心病中的一個(gè)非常嚴(yán)重的類型,為冠狀動(dòng)脈閉塞、血流中斷,使部分心肌因嚴(yán)重而持久的缺血發(fā)生局部壞死,從而導(dǎo)致心臟功能的嚴(yán)重?fù)p害,具有較高死亡率較高。對(duì)于急診胸部不適疑為心肌梗死的患者,目前多用心電圖結(jié)合心肌損傷標(biāo)志物如肌酸激酶(CK)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)、肌紅蛋白(Mb/Myo)及心肌肌鈣蛋白(cTn)I或T等進(jìn)行診斷與鑒別診斷。近年來,隨著患病率的提高,關(guān)于心肌梗塞診斷的研究也更充分。隨著研究的深入,目前認(rèn)為肌鈣蛋白是檢測(cè)心肌損傷的黃金指標(biāo)[1-3]。

1結(jié)構(gòu)特性分析

肌鈣蛋白-I以三種形式存在,分別與快收縮骨骼肌、慢收縮骨骼肌和心肌中的特異性同種異型體相對(duì)應(yīng)。骨骼肌的同種異形體在分子大小上相似,大約20 000道爾頓,然而氨基酸序列40%都不同。心臟同種異型體也顯示與骨骼肌同種異型體有40%不同,但在氨基酸末端另有31個(gè)殘基,使其分子量大約為24 000 道爾頓[4-5]。

心肌肌鈣蛋白I在心肌梗死癥狀出現(xiàn)后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)被釋放如下,在梗死后的許多天里保持在較高水平。將這些報(bào)道的數(shù)據(jù)綜合起來看到,肌鈣蛋白-I水平在胸痛出現(xiàn)后4～8小時(shí)變得不正常,在12～16小時(shí)達(dá)到峰值,梗死后持續(xù)在較高水平5～9天[4-6]。根據(jù)這些研究,肌鈣蛋白-I在CKMB和LD的診斷窗口期升高[7]。最新臨床研究也提示,存在骨骼肌損傷時(shí),肌鈣蛋白-I對(duì)探查心肌損傷比CKMB的心臟異性更高[8-9]。

心肌肌鈣蛋白I水平測(cè)定提供為在廣泛的診斷窗口期一種敏感特異性地心肌損傷診斷方法。在急性冠狀動(dòng)脈綜合征期,包括Q-波MI、非Q-波MI和不穩(wěn)定心絞痛,已觀察到心肌肌鈣蛋白I水平升高。在能夠測(cè)定出心肌肌鈣蛋白I水平的非-Q-波MI和不穩(wěn)定心絞痛的病人,觀察到死亡率極高。提示心肌肌鈣蛋白I為這些病人的危險(xiǎn)分級(jí)提供了一種方法[10]。

2檢測(cè)方法

2.1非均相免疫法(ELISA法)

非均相免疫法以“夾心”原理為基礎(chǔ)的一步法酶免疫檢測(cè)。樣品與包被心肌肌鈣蛋白I分子特異性抗體的二氧化鉻顆粒和共軛試劑(堿性磷酸酶,ALP)孵育形成顆粒/心肌肌鈣蛋白I/共軛物夾心。未結(jié)合的共軛物通過磁化分離和沖洗。分離和沖洗后,顆粒/心肌肌鈣蛋白I/共軛物夾心被轉(zhuǎn)移到比色杯,在比色杯夾心結(jié)合的堿性磷酸酶(ALP)激發(fā)和放大級(jí)聯(lián)反應(yīng)。ALP使合成的黃素腺嘌呤二核苷酸磷酸(FADP)脫磷酸釋放出FAD。FAD與脫輔基d-氨基酸氧化酶結(jié)合轉(zhuǎn)化為具有活性的holo d-氨基酸氧化酶。每個(gè)holo d-氨基酸氧化酶分子產(chǎn)生多分子過氧化氫分子(H202),在辣根過氧化物酶(HRP)存在的情況下轉(zhuǎn)化為3,5-二氯-2-對(duì)氨基苯磺酸(DCHBS)和4-氨基安替比林(4-AAP)形成在510 nm產(chǎn)生光吸收的有色產(chǎn)物[11]。測(cè)定的顏色強(qiáng)度與病人樣品中的心肌肌鈣蛋白I濃度成正比。在Dimension臨床生化系統(tǒng)上采用非均相免疫測(cè)定模塊定量檢查人血清的肌鈣蛋白I,其檢測(cè)低限為0.04 ng /mL,檢測(cè)范圍0.04-40 ng /mL,試驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間為5.4分鐘。目前該方法已成為檢測(cè)肌鈣蛋白I較成熟的方法。

2.2化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光法是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一種檢測(cè)微量抗原或抗體的標(biāo)記免疫分析技術(shù)。以該法檢測(cè)cTnI具有代表性的產(chǎn)品是美國Beckman Coulter 公司的Access 微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)、SIEMENS公司的ADVIA Centaur和ACS-180電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)。Access AccTnI采用了雙抗體一步夾心酶免疫分析的方法,以化學(xué)發(fā)光劑3-(2′-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酸氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁氨(AMPPD)為底物,用cTnI單克隆抗體包被的磁性微粒為固相載體,并用ALP標(biāo)記的cTnI另一單抗作為酶標(biāo)抗體,檢測(cè)時(shí),待測(cè)抗原與包被在固相載體的抗體及ALP標(biāo)記的抗體形成夾心復(fù)合物,發(fā)光劑AMPPD在ALP催化下脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。該系統(tǒng)最低檢出濃度為0.03 ng/mL,CV<5%, 準(zhǔn)確度可達(dá)97.8%。

ACS-180電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)則以細(xì)小的順磁性微粒為固相載體,以電化學(xué)發(fā)光劑吖啶酯標(biāo)記抗體,待加入氧化劑H202和NaOH后,吖啶酯則可在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光,光的強(qiáng)度與待測(cè)抗原的濃度成正比。該系統(tǒng)靈敏度接近0.15 ng/mL,回收率為96.97%～102.60%。

ADVIA Centaur化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)的超敏TnI檢測(cè)法是采用直接化學(xué)發(fā)光技術(shù)的3位點(diǎn)夾心免疫測(cè)試法。所含的輔助試劑用于減少非特異性結(jié)合。二元標(biāo)記試劑包括一個(gè)采用吖啶酯標(biāo)記的山羊多克隆抗肌鈣蛋白I抗體和2個(gè)生物素結(jié)合的鼠單克隆抗肌鈣蛋白I抗體。固相試劑是結(jié)合鏈霉親和素的乳膠磁顆粒。所有試劑都包含于ReadyPack中。二元標(biāo)記試劑中的抗體與樣品中的肌鈣蛋白I結(jié)合。免疫復(fù)合物中所含的生物素隨機(jī)與磁性顆粒上標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合。超敏TnI的檢測(cè)低限為0.006 ng/mL,檢測(cè)范圍0.006-50 ng/mL,回收率為91%～113%。

其干擾實(shí)驗(yàn)是根據(jù)CLSI文件EP7-A2確定干擾測(cè)試[12],將心肌鈣蛋白T、骨骼肌鈣蛋白I、原肌凝蛋白、肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白C、輕鏈肌凝蛋白、肌紅蛋白和CK-MB化合物按照規(guī)定濃度添加到已知cTnI濃度的樣品中。添加樣品的ADVIA Centaur超敏TnI檢測(cè)結(jié)果與未添加對(duì)照樣品進(jìn)行比較,結(jié)果肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白C<0.005 、骨骼肌鈣蛋白I<0.007,其余均未檢出有交叉反應(yīng),ADVIA Centaur超敏TnI測(cè)試項(xiàng)目顯示出具有高度的cTnI特異性

2.3免疫比濁法

免疫比濁分析屬液相沉淀試驗(yàn),其基本原理是抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng),形成小分子免疫復(fù)合物,在增濁劑的作用下,迅速形成免疫復(fù)合物微粒,使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度,待測(cè)抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。該法根據(jù)檢測(cè)器的位置及其所檢測(cè)的光信號(hào)的不同,可分為免疫乳膠比濁法(turbidimetry)、免疫散射比濁法(nephelometry)等。王永卿[13]報(bào)道了免疫乳膠比濁法測(cè)定cTnI的臨床應(yīng)用。該法將cTnI與膠乳顆粒表面的抗體結(jié)合,導(dǎo)致相鄰的膠乳顆粒彼此交聯(lián),進(jìn)而通過比較反應(yīng)前后透射光和散射光改變的程度,達(dá)到測(cè)定的目的。該法靈敏度可達(dá)0.3 ng/mL,線性范圍為0～25 ng/mL,批內(nèi)CV值4.0%,批間CV值4.7%。李寧沙等[14]同樣采用了此法檢測(cè)cTnI,并比較了不同抗凝劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,發(fā)現(xiàn)肝素鋰相對(duì)于肝素鈉、EDTA-K2而言,對(duì)抗原活性影響最小,是較為理想的抗凝劑。上述研究證實(shí)免疫比濁法相關(guān)性好、線性范圍寬、精密度高,具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

2.4膠體金免疫層析法(ICA)

免疫金技術(shù)是繼放射性同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記、發(fā)光熒光標(biāo)記之后的又一大標(biāo)記技術(shù)。膠體金由于具有特殊的光學(xué)性質(zhì)和電性質(zhì),例如顯色性、導(dǎo)電性和非線性光學(xué)特性等,在免疫分析方面有著其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前,金標(biāo)免疫法主要是應(yīng)用到與免疫層析技術(shù)相結(jié)合的ICA中,該法標(biāo)本用量少,簡(jiǎn)便快速,適合于cTnI的床旁檢測(cè)。國外在這方面的研究相對(duì)較多,如美國的Spectral Diagnostics 公司、德國萊幫公司等都推出了利用ICA法制備的cTnI檢測(cè)卡,其基本原理均是利用兩個(gè)cTnI單克隆抗體的結(jié)合來檢測(cè)cTnI。當(dāng)血清樣本滴到吸收孔內(nèi),第一個(gè)被膠體金標(biāo)記的抗體與cTnI結(jié)合形成一個(gè)抗體抗原結(jié)合體。第二個(gè)固定化的cTnI單抗捕捉到這個(gè)結(jié)合體,產(chǎn)生一個(gè)粉紅色的顏色帶,相對(duì)于無結(jié)合體的存在,反應(yīng)圈內(nèi)則沒有色帶。但基于該方法開發(fā)的檢測(cè)卡,雖可快速完成檢測(cè),但僅能用于cTnI定性和急性心肌梗死患者的初選,臨床應(yīng)用有一定局限性。

隨著肌鈣蛋白I廣泛應(yīng)用于臨床診斷,取得了良好的效果,作為檢測(cè)心肌損傷高度特異與敏感的指標(biāo)。目前由于其檢測(cè)方法尚未完全標(biāo)準(zhǔn)化,使不同檢測(cè)系統(tǒng)的測(cè)定結(jié)果缺乏可比性。因此,在抗體的制備、參照物和檢測(cè)試劑等許多方面均需建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。隨著在這方面研究的進(jìn)一步深入,以及抗體制備及標(biāo)記技術(shù)的不斷進(jìn)步,cTnI檢測(cè)會(huì)有更廣泛的研發(fā)及應(yīng)用前景。

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(收稿日期2009-10-29)