高滲鹽水聯(lián)合丹參預(yù)處理對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究

竇俊峰　王家祥

（1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052；2.河南省衛(wèi)生學(xué)校附屬醫(yī)院，河南 安陽 455000）お

摘 要：目的：研究高滲鹽水聯(lián)合丹參預(yù)處理對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制。方法：將75只健康雄性SD大鼠（體重230g左右），隨機(jī)分為5組，每組15只：假手術(shù)組（Ⅰ組）、缺血再灌注組（Ⅱ組）、高滲鹽水預(yù)處理組（Ⅲ組）、丹參預(yù)處理組（Ⅳ組）和高滲鹽水聯(lián)合丹參預(yù)處理組（Ⅴ組）。分別建立大鼠肝臟缺血再灌注模型，觀察肝臟缺血30min再灌注6h后血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）和腫瘤壞死因子-α （TNF-α）水平并觀察肝組織病理學(xué)改變。 結(jié)果：Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組血清中ALT、AST、LDH和TNF-α含量明顯高于Ⅰ組（P<0.05）；Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組明顯低于Ⅱ組（P<0.05）；Ⅲ組和Ⅳ組明顯高于Ⅴ組（P<0.05）；Ⅲ組和Ⅳ組之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。肝組織病理學(xué)損害：Ⅰ組最輕，Ⅱ組最重，Ⅲ、Ⅳ組次之，Ⅴ組輕于Ⅲ、Ⅳ組。 結(jié)論： 高滲鹽水、丹參預(yù)處理對大鼠肝臟缺血再灌注損傷均具有保護(hù)作用，2種藥聯(lián)合應(yīng)用效果更好。

關(guān)鍵詞：大鼠；肝臟；缺血再灌注損傷；高滲鹽水；丹參；藥物預(yù)處理

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1673-2197（2009）03-0013-02

肝臟缺血再灌注損傷是肝臟外科疾病中常見的病理過程，它可使肝代謝解毒能力降低、微循環(huán)阻力升高，嚴(yán)重者可導(dǎo)致肝功能衰竭，直接影響到疾病的預(yù)后、手術(shù)成功率和病人存活率。因此，對肝臟缺血再灌注損傷作用機(jī)制及防治的研究，具有很重要的臨床意義。最近研究表明高滲鹽水和丹參對大鼠肝臟缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用^[1-3]；但是兩藥聯(lián)合應(yīng)用是否具有更好的效果尚無定論。本實驗研究觀察了兩藥聯(lián)合應(yīng)用對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并初步探討了其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠75只，體重230g左右，河南省實驗動物中心提供。

1.2 實驗用藥品及試劑

血清TNF-α試劑盒購于中國人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所。

1.3 實驗分組

健康雄性SD大鼠75只隨機(jī)分為5組，每組15只：假手術(shù)組（Ⅰ組）、缺血再灌注組（Ⅱ組）、高滲鹽水預(yù)處理組（Ⅲ組）、丹參預(yù)處理組（Ⅳ組）和高滲鹽水聯(lián)合丹參預(yù)處理組（Ⅴ組）。術(shù)前禁食12h，自由飲水。

1.4 實驗方法

麻醉采用10%水合氯醛腹腔注射（300mg/kg體重）。Ⅰ組：單純麻醉和開腹，分離出肝十二指腸韌帶，不阻斷肝門；Ⅱ組：麻醉后開腹，開腹前10min自陰莖背靜脈緩慢注射生理鹽水（10mL/kg體重）。用無損傷動脈夾夾閉肝蒂，30 min后移走動脈夾恢復(fù)灌流，松開無損傷動脈夾恢復(fù)血流開始再灌注計時，關(guān)腹。再灌注6h后開腹，自腹主動脈取血4mL、2mL送本院生化檢驗中心檢測ALT、AST和LDH，其余血室溫靜置30min后，3000r/min離心30min，提取血清標(biāo)本-20℃保存待測TNF-α。取1.0cm×1.0cm×0.5cm大小左肝組織，置于10％ 中性甲醛溶液中，備做光鏡檢查。Ⅲ組：開腹前10min自陰莖背靜脈緩慢注射高滲鹽水（濃度7.5%，10mL/kg體重），其余步驟同Ⅱ組。Ⅳ組：開腹前10min自陰莖背靜脈緩慢注射丹參注射液（10mL／kg體重），其余步驟同Ⅱ組。Ⅴ組：開腹前10min自陰莖背靜脈緩慢注射丹參注射液5mL／kg體重和高滲鹽水（濃度7.5%，5mL/kg體重），其余步驟同Ⅱ組。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 血清生化酶檢測

全自動生化分析儀檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和乳酸脫氫酶（LDH）。1.5.2 血清TNF-α檢測

按照試劑盒說明書檢測血清TNF-α。

1.5.3 肝組織病理學(xué)檢查

10％中性甲醛溶液固定的肝組織塊石蠟包埋后，切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察組織學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析（F檢驗），組間比較用q檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清生化酶的改變

肝臟缺血30min再灌注6h后Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組血清ALT、AST、LDH水平明顯高于Ⅰ組（P<0.05）；Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組明顯低于Ⅱ組（P<0.05）；Ⅲ組和Ⅳ組明顯高于Ⅴ組（P<0.05）；Ⅲ組和Ⅳ組之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2 血清腫瘤壞死因子-α

肝臟缺血30min再灌注6h后Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組血清腫瘤壞死因子-α水平明顯高于Ⅰ組（P<0.05）；Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組明顯低于Ⅱ組（P<0.05）；Ⅲ組和Ⅳ組明顯高于Ⅴ組（P<0.05）；Ⅲ組和Ⅳ組之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.3 病理組織學(xué)觀察

光鏡下觀察，Ⅰ組肝小葉結(jié)構(gòu)及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞均正常，肝竇暢通；Ⅱ組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝竇嚴(yán)重狹窄，肝細(xì)胞水腫變性，可見部分肝細(xì)胞壞死；Ⅲ組可見部分肝細(xì)胞變性，肝血竇內(nèi)輕度瘀血，未觀察到明顯的壞死細(xì)胞；Ⅳ組肝小葉結(jié)構(gòu)尚可，可見部分肝細(xì)胞變性，肝竇仍然保持暢通，未觀察到明顯的壞死細(xì)胞；Ⅴ組肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝竇暢通，無明顯的肝細(xì)胞壞死。

3 討論

在復(fù)雜肝切除術(shù)和肝移植等手術(shù)時肝臟缺血再灌注損傷常常難以避免，減輕肝臟缺血再灌注損傷，可從多方面、多角度著手，目前預(yù)防肝臟缺血再灌注損傷的措施有藥物預(yù)處理、缺血預(yù)處理、熱休克預(yù)處理、臭氧氧化預(yù)處理、缺氧預(yù)處理、局部熱應(yīng)激預(yù)處理、缺血后處理等。在眾多的處理措施中又以藥物預(yù)處理的應(yīng)用前景最為廣闊。

藥物預(yù)處理是指利用某些活性物質(zhì)直接或間接的藥理作用來達(dá)到增強(qiáng)組織或細(xì)胞對缺血再灌注損傷的耐受性作用，從而減輕肝臟缺血再灌注損傷。

高滲鹽水用于治療肝臟缺血再灌注損傷的實驗研究報道不是很多，結(jié)果顯示在治療肝臟缺血再灌注損傷的治療中，高滲鹽水有其特有的作用機(jī)制，它能提高機(jī)體血容量，改善微循環(huán)^[4]，增加心臟功能，改善血液動力學(xué)，并能減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹及肺泡內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，減少組織器官淤血和水腫，從而減輕全身性炎癥反應(yīng)。FAHMEN等^[5]研究也表明高滲鹽水能減少中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)所致的組織損傷。最近有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，高滲鹽水預(yù)處理明顯增強(qiáng)缺血再灌注后肝臟血紅素加氧酶-1（HO-1）mRNA及蛋白表達(dá)，明顯改善肝臟微循環(huán)，對肝臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。但是高滲鹽水的作用機(jī)理目前還不十分清楚，尚需進(jìn)一步研究。

丹參是近年來引起人們重視的一種傳統(tǒng)中藥，國內(nèi)在丹參對動物肝臟缺血再灌注損傷的研究上已經(jīng)取得一定成果，證明其在酶學(xué)指標(biāo)和組織切片上都有一定的效果。丹參注射液是丹參中提取的混合液，主要成分為丹參素、丹參酮、隱丹參酮和原兒茶醛等，臨床上可輔助治療多種病因引起的肝臟損傷^[6]。丹參對肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與抗氧自由基、抑制細(xì)胞凋亡及改善低溫保存肝臟的能量代謝作用有關(guān)^[7]。同時丹參還能保護(hù)缺血或殘肝細(xì)胞以促進(jìn)肝細(xì)胞再生，并可在低溫情況下提高組織中ATP含量和Na+-K+-ATP酶活性繼而減輕器官在低溫下的損傷^[8]。本實驗通過聯(lián)合應(yīng)用高滲鹽水和丹參探討它們對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示單獨應(yīng)用高滲鹽水或丹參均能明顯降低血清中AST、ALT、LDH及TNF-α的水平，聯(lián)合應(yīng)用效果更好，已經(jīng)過病理觀察證實。

綜上所述，我們認(rèn)為高滲鹽水和丹參可以降低肝臟缺血再灌注時TNF-α的水平，減輕TNF-α介導(dǎo)的一系列肝臟損傷，從而對肝臟缺血再灌注損傷起保護(hù)作用，兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用。

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（責(zé)任編輯：陳涌濤）