倍他司汀、西咪替丁對(duì)原發(fā)性肝癌大鼠肝微粒體CYP450的影響

陳艷平 張毅民 王乃平 韋錦斌

[摘要] 目的 研究倍他司汀和西咪替丁對(duì)原發(fā)性肝癌大鼠肝微粒體CYP450的影響。方法 以二甲基氨基偶氮苯誘發(fā)大鼠原發(fā)性肝癌,觀察倍他司汀和西咪替丁對(duì)大鼠第一相酶細(xì)胞色素P450的影響。結(jié)果整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,倍他司汀組和西咪替丁組大鼠細(xì)胞色素P450含量處于低水平并呈下降趨勢(shì),與模型組比較,差異顯著(P<0.01)。結(jié)論 倍他司汀和西咪替丁可以抑制原發(fā)性肝癌大鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450活性,從而抑制二甲基氨基偶氮苯在肝臟中的活化而降低他的致癌性及化學(xué)肝損傷。

[關(guān)鍵詞] 原發(fā)性肝癌;倍他司汀;西咪替丁;CYP450

[中圖分類(lèi)號(hào)] R965[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1004-8650(2009)06-023-03

The Effects of Betastine and Cimetidine on CYP450 of the Primary Liver Cancer of Wistar Rats

CHEN Yan-ping1, ZHANG Yi-min2, WANG Nai-ping3, WEI Jin-bin3

(1.Changsha Central Hospital Medical Section,HunanChangsha410005China;2.Fujian Provincial Corps Hospital, Chinese People's Armed Police Forces,Fuzhou350003China;3.Guangxi Medical University,GuangxiNanning530021,China)

[Abstract] ObjectiveTo study the effects of betastine and cimetidine on CYP450 of the primary liver cancer of Wister rats。MethodsDimethylamino-axobenzene was used to induce the rat liver cancer model in order to observe the influences of BET and CIM on the content of CYP450。Results During the experiment,the contents of CYP450 in betastine group and cimetidine group were maintained a low level and showed a tendency of decreasing;Compared to the model group,there was significant difference (P<0.01) between them。Conclusion Betastine and cimetidine can decrease the content of CYP450 of the primary liver cancer of Wister rats and also restrained dramatically activity of dimethylamino-axobenzene in the liver of rat and reduced the hepatocarcinoma rate.

[Key words] primary liver cancer;Betastine;Cimetidine;CYP450

CYP450是體內(nèi)參與生物活性物質(zhì)、激素和外來(lái)異物包括藥物代謝滅活的重要酶系,酶活性的高低直接影響到物質(zhì)代謝的速度。

倍他司汀(betahistine, BET,抗眩啶)是組胺H1受體激動(dòng)劑,能增加內(nèi)耳、肝臟等組織血流量,臨床主要用于內(nèi)耳眩暈癥[1]。經(jīng)查新,國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)BET用于肝癌預(yù)防、治療的報(bào)道。王乃平等發(fā)現(xiàn)BET有預(yù)防、治療大鼠原發(fā)性肝癌的趨勢(shì)[2],同時(shí),本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BET為細(xì)胞色素P450抑制劑。

西咪替丁(cimetidine,CIM)是一種H2受體拮抗劑,同時(shí)也是一種經(jīng)典的細(xì)胞色素P450的抑制劑,臨床上用于消化性潰瘍,近年發(fā)現(xiàn)他有抗腫瘤作用,可以抑制許多實(shí)驗(yàn)性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移并可以延長(zhǎng)動(dòng)物的存活期,臨床上被用于抗腫瘤(如大腸癌)[3]。本實(shí)驗(yàn)用二甲基氨基偶氮苯(DAB)誘導(dǎo)大鼠原發(fā)性肝癌模型,以期研究BET和CIM對(duì)原發(fā)性肝癌大鼠肝微粒體CYP450的影響。

1材料和方法

1.1動(dòng)物

Wistar大鼠,雄性,體重(130±20)g,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2試劑及藥物

BET[日本衛(wèi)材株式會(huì)社,衛(wèi)材(蘇州)制藥有限公司分裝,批號(hào):020803]; CIM(原料藥,西南制藥一廠,批號(hào):030220);DAB(上海遠(yuǎn)航化工廠,批號(hào):011112);蛋白定量(雙縮脲法)測(cè)試盒( 南京建成生物工程研究所,批號(hào):030512)。

1.3主要儀器設(shè)備

高速分散勻質(zhì)機(jī)(FJ-200型,上海標(biāo)本模型廠);高速低溫離心機(jī)(EppendorfCentrifuge 5804R型,德國(guó));紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(DU-640G型,美國(guó)Beckman公司);雙光束紫外分光光度計(jì)(LAMB DAB1020,美國(guó))。

1.4大鼠原發(fā)性肝癌模型的建立及給藥

1.4.1 誘癌藥糧及藥物的配制:用DAB制成6%的花生油溶液,每100ml DAB油溶液與5kg大米拌勻,配成即每克大米含1.2mg DAB的誘癌藥糧;將BET按大鼠7.2mg/kg給藥量用水配成混懸液;將CIM按大鼠100mg/kg給藥量用水配成混懸液。

1.4.2 分組、給藥及模型建立:將雄性Wistar 大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(30只)、模型組(68只)、BET(45只)組和CIM(45只)組。對(duì)照組,用普通大米飼養(yǎng),飲自來(lái)水;模型組,用誘癌藥糧飼養(yǎng),飲自來(lái)水;BET組和CIM組分別飲用各藥物混懸液,用藥同時(shí),先給普通大米飼養(yǎng)2周,后給誘癌藥糧飼養(yǎng)。模型組和各給藥組均用誘癌藥糧飼養(yǎng),以誘發(fā)肝癌形成,時(shí)間為32周。

1.5大鼠肝臟標(biāo)本、肝微粒體及血清的制備

在給誘癌藥糧后第8周、第16周,每組大鼠各取5只,32周后取全部大鼠,稱(chēng)其體重,拔眼球取血,脫頸椎處死,迅速剖腹取肝臟,稱(chēng)肝重。剪部分組織用10%甲醛溶液固定,做病理切片檢查。取部分肝臟迅速置于液氮中存放后置-80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩Ｓ嘞赂闻K用注射器吸取預(yù)冷1.15% KCl沖洗至灰白色,吸干。取肝重0.5左右,加2倍肝重的15%甘油-20mMPBS溶液,用高速分散勻漿機(jī)勻漿。將勻漿液于高速成冷凍離心機(jī)離心10min(3000rpm),取富含肝微粒體(MS)的上清液,繼續(xù)冷凍離心1h(10000rpm),用15%甘油-20mMPBS溶液1ml稀釋沉淀物,即得肝微粒體(MS),于-80℃冰箱保存?zhèn)錅y(cè)。血液凝固后,以3,000rpm,4℃離心15min,取上清即血清,-20℃保存?zhèn)錅y(cè)。

1.6CYP450含量測(cè)定

取各組不同時(shí)期大鼠MS標(biāo)本各5份進(jìn)行測(cè)定,其中蛋白質(zhì)含量測(cè)定依蛋白定量測(cè)定(雙縮脲法)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定肝微粒體MS蛋白含量;參見(jiàn)文獻(xiàn)[4],Beckman比色杯中加入15%甘油-20mMPBS溶液2ml+MS100μl+數(shù)mg保險(xiǎn)粉,于Beckman DU-640紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)調(diào)零,用小兒頭皮針輸液管通入CO 30s,樣品掃描測(cè)定,記錄420nm、450nm、490nm處的OD值,根據(jù)公式計(jì)算各樣品P450含量。

1.7統(tǒng)計(jì)方法

酶學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以SPSS V11.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或?字2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1成癌率

本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明,用DAB藥糧誘癌24周后為肝癌形成期,本實(shí)驗(yàn)中所有死亡動(dòng)物(無(wú)法得到完整尸體者除外)經(jīng)解剖或根據(jù)病理檢查,最早1例肝癌出現(xiàn)于25周(模型組),現(xiàn)以25周動(dòng)物數(shù),25-32周成癌數(shù)計(jì)算成癌率。結(jié)果顯示,CIM組和BET組的成癌率顯著低于模型組(Tab. 1)。

2.2CYP450的含量變化

給予大鼠誘癌藥糧8周后,模型組CYP450含量有所增加,與對(duì)照組比較有差異(P<0.05);BET組和CIM組CYP450含量處于較低水平,與對(duì)照組比較有差異(P<0.05),與模型組比較差異顯著(P<0.01)。16周后,模型組CYP450升高較快達(dá)到峰值,與對(duì)照組比較差異明顯(P<0.05);BET組和CIM組仍然處于較低水平,與對(duì)照組比較差異顯著(Ρ<0.01),而與模型組比較差異顯著(Ρ<0.01)。32周后,模型組CYP450明顯下降,達(dá)到最低值,與對(duì)照組比較差異顯著(Ρ<0.01);BET組一直處于低水平,與對(duì)照組和模型組比較均有差異(Ρ<0.05);CIM組也一直處于低水平,與對(duì)照組比較差異明顯(Ρ<0.01),而與模型組比較差異顯著(Ρ<0.01);BET組與CIM組比較三個(gè)時(shí)期差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Tab. 2,Fig.1)。

3討論

本實(shí)驗(yàn)以含DAB的誘癌藥糧進(jìn)行原發(fā)性肝癌模型復(fù)制,從病理切片可見(jiàn),模型組大鼠肝癌為高分化的肝細(xì)胞肝癌。肝癌發(fā)生率為69.57%,說(shuō)明肝癌模型復(fù)制成功。而B(niǎo)ET組和CIM組大鼠在實(shí)驗(yàn)早期肝臟的損傷程度明顯較模型組輕,成癌率明顯比模型組低,說(shuō)明BET和CIM可以減輕或延緩大鼠肝損傷,降低成癌率。

DAB為偶氮類(lèi)化合物,與廣泛存在于環(huán)境中的致癌物質(zhì)結(jié)構(gòu)類(lèi)似,是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性肝癌中的一種致癌率較高的致癌劑。在體內(nèi)DAB經(jīng)肝臟CYP450的N-去甲基化,N-氧化作用及酯化作用,轉(zhuǎn)化為活性致癌物。DAB對(duì)肝臟的損傷,一方面表現(xiàn)為非特異性毒性作用,DAB作用于肝細(xì)胞,損傷肝細(xì)胞一些重要酶系,如定位于細(xì)胞線(xiàn)粒體嵴和內(nèi)膜上的琥珀脫氫酶(SDH),定位于肝細(xì)胞膜的5,-核苷酸酶(5,-NH)等,使肝細(xì)胞發(fā)生變性、壞死,繼而壞死周邊肝細(xì)胞明顯再生,膽管上皮增生及大量纖維結(jié)締組織增生而形成假小葉及再生結(jié)節(jié),將肝組織轉(zhuǎn)變成肉眼可見(jiàn)的顆粒型肝硬變,進(jìn)而肝細(xì)胞或膽管上皮過(guò)度增生、異型增生以至癌變。個(gè)別病例也可能并未形成肝硬化而直接形成肝癌。另一方面,由于DAB可能破壞肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線(xiàn)粒體、核糖體等細(xì)胞器,從而影響蛋白質(zhì)合成。組胺受體蛋白的減少,降低了機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的自然免疫反應(yīng),還可能會(huì)對(duì)組胺的代謝及效應(yīng)產(chǎn)生影響,導(dǎo)致肝細(xì)胞及磷脂代謝的紊亂而加重肝細(xì)胞的損害,造成惡性循環(huán),促進(jìn)肝癌癌變的發(fā)展[5]。

CYP450同工酶可分為“解毒”和“增毒”兩大類(lèi)[6],CYP1A和CYP2E在多種前致癌物或前毒物的代謝活化中起重要的催化作用,屬于"增毒"類(lèi)CYP450,存在對(duì)癌癥的多態(tài)易感性[7]。從CYP450的含量變化曲線(xiàn)可見(jiàn),模型組大鼠中的CYP450含量先升后降,而B(niǎo)ET組與CIM組大鼠一直處于較低水平,并有下降趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BET與CIM同屬肝藥酶抑制劑,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)表明他們可能可以抑制這類(lèi)"增毒"CYP450活性,從而抑制DAB在肝臟中的活化而降低他的致癌性及化學(xué)肝損傷。當(dāng)然,BET和CIM減輕或延緩大鼠肝損傷、降低成癌率的這種作用或許還與其分別作為組胺的H1受體激動(dòng)劑和H2受體拮抗劑有關(guān)。組胺通過(guò)不同受體產(chǎn)生雙重但相互拮抗的免疫調(diào)節(jié)作用,這與腫瘤的發(fā)生有密切聯(lián)系,即組胺受體介導(dǎo)的腫瘤雙向效應(yīng)[8]:H1受體興奮可增強(qiáng)免疫反應(yīng),H2受體興奮可抑制免疫反應(yīng)。現(xiàn)已證明,組胺可抑制促分泌素誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增生反應(yīng)[9]。動(dòng)物及人體中的抑制性T細(xì)胞上有組胺H2受體[10],而效應(yīng)T細(xì)胞或反抑制性T細(xì)胞膜上有組胺H1受體[11]。組胺的免疫抑制效應(yīng)主要由H2受體介導(dǎo),H2受體拮抗劑可以阻斷組胺對(duì)淋巴因子和淋巴細(xì)胞增殖的抑制,增加對(duì)腫瘤細(xì)胞的自然免疫反應(yīng),抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[12],說(shuō)明組胺通過(guò)淋巴細(xì)胞上H1受體興奮可增強(qiáng)免疫反應(yīng),H2受體興奮可抑制免疫反應(yīng)。因此BET作為H1受體激動(dòng)劑,CIM作為H2受體拮抗劑都能增強(qiáng)大鼠的免疫反應(yīng),從而減輕或延緩致致癌劑DAB對(duì)大鼠肝損傷、降低成癌率。

BET和CIM能減輕或延緩致癌劑DAB對(duì)大鼠肝損傷、降低成癌率這種作用的作用機(jī)制究竟是因?yàn)槠湟种七@類(lèi)“增毒”CYP450活性,從而抑制DAB在肝臟中的活化而降低他的致癌性及化學(xué)肝損傷,還是因?yàn)榕c其分別作為組胺的H1受體激動(dòng)劑和H2受體拮抗劑,從而增強(qiáng)大鼠的免疫反應(yīng)有關(guān),或者是共同作用以及誰(shuí)占主導(dǎo)作用,還有待進(jìn)一步研究。

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(收稿日期2009-04-06)