自體骨移植替代方法：一個古老而又年輕的話題

鄒學農(nóng)

專家論壇

自體骨移植替代方法：一個古老而又年輕的話題

鄒學農(nóng)

長期以來，自體骨移植是脊柱融合、創(chuàng)傷或腫瘤切除后骨缺損修復(fù)的金標準，但自體骨移植存在取材有限、失血、延長手術(shù)時間、增加病人痛苦等缺點，而且會引起取材部位并發(fā)癥。為了減少自體骨供區(qū)并發(fā)癥，提高骨缺損修復(fù)能力，各種具有骨傳導(dǎo)/骨誘導(dǎo)潛能的自體骨替代材料應(yīng)運而生，主要包括成骨性、骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性三類產(chǎn)品。

由于不同來源異體骨質(zhì)量不穩(wěn)定與成骨能力差異，異體骨移植的臨床效果一直令人失望。目前臨床上幾種骨移植替代材料，如珊瑚羥基磷灰石、磷酸鈣、硫酸鈣、三磷酸鈣和膠原-基質(zhì)羥基磷灰石復(fù)合材料，常用于骨缺損的填充與脊柱融合。由于缺乏足夠的臨床數(shù)據(jù)支持，醫(yī)生在選用這些產(chǎn)品時往往難以決策。因此，骨科醫(yī)師應(yīng)充分了解這些材料的特性，根據(jù)臨床需要選擇合適的骨移植替代方法。

1965年，Urist等在《科學》雜志上報告了骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）的發(fā)現(xiàn)，被認為是最有價值的突破之一。隨著分子克隆技術(shù)的發(fā)展，骨誘導(dǎo)生長因子的研究越來越多。目前在國際上基因重組BMPs已經(jīng)批量生產(chǎn)。重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）和成骨蛋白-1（osteogenic protein-1，OP-1）在臨床應(yīng)用中取得了令人鼓舞的效果。盡管如此，臨床上仍然面臨許多新的挑戰(zhàn)，如劑效關(guān)系、載體選擇、抗體產(chǎn)生的可能以及高昂的生產(chǎn)成本等，在像我國這樣的發(fā)展中國家更加難以推廣應(yīng)用。因此，開發(fā)高效價廉的新產(chǎn)品與新方法，將具有極大的發(fā)展前景。

近30年來，隨著材料科學的進展，金屬、人工陶瓷、聚合物復(fù)合材料均可用于骨組織工程支架和骨科植入體的制作。將支架材料/植入體直接植入病人體內(nèi)，僅通過周圍組織的長入來達到生物學固定，難以實現(xiàn)有目的、可控制的組織再生。而在植入病人體內(nèi)前，接種足夠的種子細胞并復(fù)合細胞因子、生長因子、基因等，在生物反應(yīng)器中誘導(dǎo)細胞擴增與分化，或直接植入病人體內(nèi)，以機體作為活體生物反應(yīng)器在體內(nèi)孵化細胞，可以達到精確控制組織再生的目的。因此，應(yīng)用組織工程技術(shù)不僅可加速組織愈合，還可改善支架材料/植入體的生物相容性，縮短病人的住院時間，延長植入裝置的壽命，尤其適用于種子細胞來源有限、骨愈合功能不良的骨缺損患者以及需要進行骨關(guān)節(jié)功能重建的腫瘤患者，從而為尋找新的骨移植替代方法提供了理論和方法。

長期以來，尋找安全有效的自體骨移植替代方法一直是國際骨科研究的熱點之一。本文就自體骨移植替代方法這一古老而又年輕的話題作一簡要評述。

1 異體成骨性骨移植替代方法

同種異體骨及脫鈣骨基質(zhì)（demineralized bone matrix，DBM）是最常用的成骨性骨移植材料。雖然異體骨來源豐富，但其卻有傳染疾病的危險[1]；經(jīng)過程序化處理的DBM，仍然存在排異反應(yīng)[2]。動物試驗表明，與自體骨移植比較，同種異體骨脊柱融合率低、移植骨吸收快、感染率高[3]。即便如此，同種異體骨移植仍廣泛應(yīng)用于需要植骨融合的脊柱不穩(wěn)病人。DBM是從同種異體骨中提取的脫鈣骨基質(zhì)，為另一種具有骨誘導(dǎo)性能的骨移植替代產(chǎn)品。DBM來源豐富，動物和臨床試驗均證實它可誘導(dǎo)骨形成[4]。人類DBM含有多種BMPs，但在創(chuàng)傷修復(fù)和骨骼重建的前瞻性隨機臨床試驗中未能取得與自體骨移植相同的效果[5]。

2 骨傳導(dǎo)性移植替代方法

目前，美國食品藥品管理局（FDA）已批準多種具有骨傳導(dǎo)性能的骨移植替代產(chǎn)品包括珊瑚羥基磷灰石、膠原-羥基磷灰石復(fù)合材料、磷酸鈣、硫酸鈣和三磷酸鈣（表1）的臨床應(yīng)用。通過新骨長入或長上骨移植替代材料，這些產(chǎn)品通常用于骨缺損的填充與脊柱融合。由于材料的化學組成、結(jié)構(gòu)強度、吸收率與塑形率變化較大，臨床上不能確切證實此類產(chǎn)品的有效性。此外，其可操作性不強，易從填充部位分散至周圍軟組織中，一旦發(fā)生感染，難以將骨移植替代材料清除干凈。此外，一些宿主的骨床可能不太適合組織生長，從而影響材料與宿主骨整合。

多孔泡沫金屬材料是上世紀80年代后期國際上迅速發(fā)展起來的一種物理功能與結(jié)構(gòu)一體化的新型工程材料。當制作成人工骨時，除了有利于骨組織的生長外，還能通過孔隙率的多少來調(diào)整其彈性模量與人體骨的差異，實現(xiàn)結(jié)構(gòu)和性能上與宿主骨的進一步親和。多孔泡沫金屬鉭復(fù)合材料（金屬小梁骨）具有非降解特性，物理化學性能穩(wěn)定。這一復(fù)合材料是采用化學蒸汽沉積法在均勻的網(wǎng)狀碳骨架表面噴涂一層惰性金屬鉭制作而成，其孔徑與孔隙率由泡沫塑料的炭化骨架決定，孔隙間相互連通，彈性模量接近于松質(zhì)骨。金屬小梁骨制作的非骨水泥型人工關(guān)節(jié)骨接觸面在臨床上應(yīng)用已有20余年的歷史，通過骨長入金屬小梁骨的多孔界面發(fā)揮生物學固定作用。近年來，國際上也開發(fā)了金屬小梁骨椎間融合器，經(jīng)過作者的系列研究，2007年獲得FDA批準應(yīng)用于臨床。在手術(shù)期間分離家豬骨髓單個核細胞，將單個核細胞復(fù)合透明質(zhì)酸水凝膠載入空心的金屬小梁骨椎間融合器。結(jié)果顯示，3個月后在融合器中心孔內(nèi)新骨形成與自體骨或rhBMP-2復(fù)合Collagraft材料沒有區(qū)別，但中心孔內(nèi)小梁骨更為成熟[6]。而在金屬小梁骨融合器的微孔內(nèi)，自體骨移植3個月后骨長入平均骨量僅11%，6個月后的平均骨量為16%[7]；骨髓單個核細胞復(fù)合透明質(zhì)酸水凝膠載入融合器中心孔內(nèi)3個月后，新骨長入微孔內(nèi)的平均骨量達20%[6]。脊柱融合時短期應(yīng)用雙膦酸鹽福善美[8]，金屬小梁骨作為載體局部釋放唑來霉素[9]，可促進新骨長入金屬小梁骨的微孔內(nèi)，從而有利于金屬小梁骨與宿主骨的生物學整合。提供初始堅強內(nèi)固定，可將金屬小梁骨椎間融合器自體骨移植后的融合率從64%提高到91%[7]。應(yīng)用小角度X線散射掃描比較金屬小梁骨與鈦合金脊柱融合器的骨長入情況，結(jié)果證實金屬小梁骨的楊氏模量明顯低于鈦合金，減少了應(yīng)力遮擋，使新骨更容易直接長入金屬小梁骨中[10]。因此，金屬小梁骨不僅在臨床上可用于骨科創(chuàng)傷與骨腫瘤手術(shù)后的大塊骨缺損以及脊柱融合，而且可作為骨組織工程支架以及藥物緩釋載體。

表1 FDA批準的傳導(dǎo)性骨移植替代產(chǎn)品的特性

3 骨誘導(dǎo)性移植替代方法

盡管骨誘導(dǎo)性生長因子的實驗結(jié)果令人鼓舞，但難以在臨床廣泛應(yīng)用。直到最近采用重組技術(shù)，以rhBMP-2為代表的產(chǎn)品實現(xiàn)了批量生產(chǎn)，這一情況才有所改觀。rhBMP-2在動物模型中可誘導(dǎo)新骨形成，動物實驗充分證實了rhBMP-2的安全性和有效性[11]。在臨床上，rhBMP-2復(fù)合不同植入體應(yīng)用于脊柱融合、骨科創(chuàng)傷與口腔頜面外科。這些產(chǎn)品先后獲得FDA認證，包括INFUSETM骨移植替代產(chǎn)品rhBMP-2/ACS+LT-CAGE，2002年7月被批準用于脊椎融合術(shù)中治療某些脊柱退行性病變；INFUSE?Bone Graft 2004年被批準用于髓內(nèi)釘固定的開放性脛骨骨折，2007年3月被批準用于替代自體骨修復(fù)拔牙窩與增高牙槽嵴。由于大量臨床前與臨床研究的完成以及上述產(chǎn)品的FDA認證，rhBMP-2成為目前發(fā)表論文最多、取得重要進展的骨科研究熱點之一。

rhBMP-2因其價格昂貴而難以進行廣泛的推廣應(yīng)用。最近，動物來源的骨蛋白提取物（animal bone protein extracts）獲得成功提取。它不僅原料取自天然，其中的Ⅰ型膠原是細胞之間連接的支架，而且含有多種細胞生長因子[12]，可刺激人骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells,MSCs）增殖與成骨分化[13]，因此被認為是一種最有前途且性價比較高的自體骨移植替代材料。從牛骨中提取的骨蛋白提取物在動物實驗中取得良好的脊柱融合效果[14]，BMPs提純物（Ne-Osteo）的前期臨床應(yīng)用亦取得成功[15]。Colloss?主要含有牛Ⅰ型膠原和難溶性骨基質(zhì)蛋白，可成功修復(fù)動物上頜及中耳骨，動物實驗和臨床試驗亦證實其能夠促進脊柱融合[16]。但由于瘋牛病的原因，牛骨來源的骨蛋白提取物一直未獲得FDA認證。

另一種動物來源的骨蛋白提取物是由德國Ossacur AG公司從冰島馬骨中提取的骨蛋白凍干產(chǎn)品（COLLOSS?E）。體外試驗顯示其含有多種細胞生長因子[12]。動物實驗表明COLLOSS?E可異位成骨[17]，其脊柱整合效果與自體骨移植相當。COLLOSS?E經(jīng)軟骨內(nèi)成骨的機理及骨形成早期的骨結(jié)構(gòu)與rhBMP-2不同[18]。通過復(fù)合三維支架材料或生物陶瓷，COLLOSS?E也可用于骨缺損修復(fù)或人工關(guān)節(jié)周圍的填充[19]。COLLOSS?E于2007年獲得FDA認證和CE商標，目前由德國Biomet公司經(jīng)銷，結(jié)合PEEK椎間融合器在歐洲國家應(yīng)用于臨床。高效價廉的特性使其市場前景優(yōu)于INFUSE?，具有重要的臨床應(yīng)用價值。

4 組織工程骨移植替代方法

在骨科領(lǐng)域里，以多孔生物材料支架結(jié)合成骨細胞是最有前途的自體骨移植替代方法。然而，基于支架材料的骨組織工程技術(shù)所遇到的一些基本問題尚未完全解決，從而阻礙了該技術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用。這些問題包括：（1）常規(guī)接種的種子細胞在支架材料中分布不均且接種效率低下；（2）種子細胞的來源有限；（3）種子細胞的免疫異源性反應(yīng)等。

傳統(tǒng)的常規(guī)靜態(tài)接種方法細胞接種效率低下，細胞在支架材料中分布不均。為了提高細胞接種效率，有研究采用動態(tài)接種方法如過濾法、振蕩灌注法、離心法、連續(xù)灌注法[20]等替代靜態(tài)接種方法。但這些研究分別在單一類型支架材料上進行試驗，由于不同支架材料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)與形態(tài)各異，直接影響細胞接種效率與功效，所得結(jié)果相互矛盾，難以達到理想效果。

骨髓組織除含有造血干細胞外，還含有MSCs。當它以低密度接種時，可形成成纖維細胞樣克隆，因此又被稱為“成纖維細胞集落形成單位”(colony forming units-fibroblasts,CFU-Fs)。每個克隆各自來源于一個增殖的祖細胞。在適宜的條件下，MSCs具有向中胚層組織細胞分化的能力，根據(jù)其所處環(huán)境轉(zhuǎn)化為不同類型組織細胞如成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等，并且能在體外自我更新。MSCs在體外表現(xiàn)出高度的增殖能力，1 ml骨髓抽取物最終能產(chǎn)生數(shù)億個MSCs[21]。由于MSCs易于獲得，且具有高度的自我更新能力和多向分化潛能，因此被認為是理想的骨組織工程種子細胞。然而，疾病或衰老可使MSCs內(nèi)在特性與維持“干細胞”特性的壁龕(niche)微環(huán)境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生改變，從而影響MSCs的自我更新和定向分化，使其數(shù)量與分化能力迅速降低。在很大程度上，這些改變?nèi)Q于干細胞自我更新和定向分化每一階段特定的基因表達方式[22]。例如，沉默干細胞自我更新的基因表達將激活干細胞分化細胞表型特定的基因轉(zhuǎn)錄因子。而啟動和維持干細胞分化過程中特定的基因表達方式與其獨特的表觀遺傳調(diào)控相關(guān)。因此，了解干細胞自我更新和定向分化過程中特定基因表達方式的表觀遺傳調(diào)控機制，為種子細胞來源有限、大塊骨缺損、骨愈合功能不良患者提供安全有效的組織工程骨移植替代新方法，具有重要的理論意義與臨床應(yīng)用價值。

5 展望

尋找自體骨移植替代方法一直是骨科醫(yī)生面對的最具吸引力和挑戰(zhàn)性的難題，目前所用的替代方法尚無法同時具備良好的骨形成、骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)性能。綜合利用支架材料、細胞因子和干細胞，通過標準化的組織工程技術(shù)構(gòu)建個體化組織工程骨是目前骨缺損修復(fù)與脊柱融合研究的熱點，也是建立安全有效的自體骨移植替代方法的發(fā)展方向。

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（本文編輯 白朝暉）

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