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    枯草芽孢桿菌抑菌作用的實驗研究

    2009-04-21 06:44:50范永瑞
    企業(yè)導(dǎo)報 2009年1期
    關(guān)鍵詞:枯草芽孢桿菌大腸桿菌

    范永瑞

    【摘要】 枯草芽孢桿菌抗均蛋白對很多病菌都有抑制或殺滅作用,實驗中對大腸桿菌的拮抗作用進行了研究。結(jié)果表明,枯草芽孢桿菌大腸桿菌拮抗作用較為明顯。

    【關(guān)鍵詞】 枯草芽孢桿菌;大腸桿菌;紫外線誘變

    芽孢桿菌在自然界分布非常廣泛,多數(shù)芽孢桿菌的抗菌物質(zhì)具有抗菌譜廣,對酸堿度要求不高,熱穩(wěn)定性好,易于進行分子加工等特點,這些都為開發(fā)新型天然防腐劑以及生物防治劑提供了很好的條件??莶菅挎邨U菌可由稻草中分離得到,對許多植物病原生物具有拮抗作用的非病原微生物。研究枯草芽孢桿菌對大腸桿菌的拮抗作用,并通過紫外誘變手段篩選出高抗大腸桿菌的菌株。

    一、材料與方法

    1、供試菌種

    實驗菌種 :枯草芽孢桿菌、大腸桿菌

    2、培養(yǎng)基

    液體種子培養(yǎng)基:為牛肉膏蛋白凍培養(yǎng)基(不加瓊脂粉)。

    固體種子培養(yǎng)基:在液體種子培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入18g/L的瓊脂粉。

    3、枯草芽孢桿菌的制備

    取稻草約500g,浸泡在清水中2h,再將其煮沸30min,后37℃下培養(yǎng)。24h后再將其煮沸30min,吸取液體1ml于9ml無菌水中,搖勻制成菌懸液,將菌懸液滴兩滴在固體種子培養(yǎng)基上,涂布均勻,37℃下培養(yǎng)48h。最后挑單菌落于液體種子培養(yǎng)基中,37℃下培養(yǎng)48h。

    4、枯草芽孢桿菌的紫外誘變

    取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的枯草芽孢桿菌菌液離心(10000r/min,20min),取沉淀收集細(xì)胞,用無菌生理鹽水洗滌2次。玻璃珠振蕩15min。分別取10ml菌懸液于5個直徑9cm的無菌培養(yǎng)皿中,搖勻。無菌條件下在30W,60CM的紫外燈下打開培養(yǎng)皿蓋分別照射60s,90s,120s,150s,180s。不同誘變時間處理的菌懸液各取1ml加入液體種子培養(yǎng)基中37℃黑暗下培養(yǎng)24h。同時取1ml未誘變的菌懸液培養(yǎng)作為對照。致死率=(對照組菌數(shù)-此誘變時間下菌數(shù))÷對照組菌數(shù)×100%

    5、誘變菌株的篩選

    培養(yǎng)24h的枯草芽孢桿菌吸取1ml于裝有9ml無菌水的試管中,搖勻;再從中吸取1ml菌懸液,重復(fù)上個步驟,直至稀釋到10-4。用異步培養(yǎng)法挑選高產(chǎn)單菌落。即將稀釋到10-5的菌懸液涂布平板,然后將其倒扣于裝有一薄層氯仿的培養(yǎng)皿蓋熏蒸50min,讓菌落固定在固體種子培養(yǎng)基表面。移去培養(yǎng)皿蓋,讓平板中的氯仿?lián)]發(fā)40min。再取0.5ml 107-108cfu/ml的大腸桿菌菌懸液涂布在此平板上。待平板晾干后37℃培養(yǎng)72h。取所有平板中抑菌圈最大的單菌落擴大培養(yǎng)。

    二、結(jié)果與分析

    1、不同培養(yǎng)時間對抑菌效果的影響

    圖1 抑菌圈隨培養(yǎng)時間的變化

    枯草芽孢桿菌隨著培養(yǎng)時間的增加,他的抑菌效果總的來說呈上升趨勢,但其中有抑菌圈變小的過程,這不是說明抗菌蛋白的效果降低了,而可能是由抗菌蛋白的產(chǎn)生時間于大腸桿菌的擴增時間的差別造成的??咕鞍资且娇莶菅挎邨U菌的平穩(wěn)期時才會產(chǎn)生,在這之前是由于接種液中含有抗菌蛋白,它在抑制大腸桿菌的生長。當(dāng)它逐漸消耗而枯草芽孢桿菌處于非平穩(wěn)期,沒有新的抗菌蛋白產(chǎn)生時,大腸桿菌處于快速增殖的過程,大腸桿菌就會逐漸蔓延,掩蓋部分抑菌圈,就表現(xiàn)為抑菌圈的減小。當(dāng)枯草芽孢桿菌達(dá)到平穩(wěn)期后,抗菌蛋白大量產(chǎn)生,使大腸桿菌死亡,抑菌圈就逐漸擴大。

    2、不同接種量芽孢桿菌對大腸桿菌的抑制效果

    圖2 不同接種量對抑菌效果的影響

    經(jīng)過不同劑量的枯草芽孢桿菌抑制大腸桿菌,經(jīng)測量發(fā)現(xiàn)抑菌圈先隨劑量的增加而增加,200μl的時候達(dá)到最大;后就逐漸變小。其原因是劑量越多,它含的枯草芽孢桿菌就越多,產(chǎn)生的抗菌蛋白越多,所以抑菌效果越好;但達(dá)到一定數(shù)量后,在有限的營養(yǎng)中枯草芽孢桿菌之間會產(chǎn)生競爭關(guān)系,反而會抑制菌群的生長,降低了抗菌蛋白的產(chǎn)生量。

    3、不同紫外誘變不同時間的結(jié)果

    在30W,60CM處誘變不同時間,60s時致死率最低,但其正突變率太小。隨時間的增加,致死率越來越大,180s時菌種幾乎全被殺死。90s,120s,150s三個時段的致死率相差不大,而且在可接受范圍內(nèi)。但150s時其正突變率達(dá)到104%,是最高的,所以150s誘變時間比較合適。

    四、討論

    枯草芽孢桿菌抗均蛋白對很多病菌都有抑制或殺滅作用,實驗中對的拮抗作用進行了研究。結(jié)果表明,枯草芽孢桿菌大腸桿菌拮抗作用較為明顯。在農(nóng)林和經(jīng)濟作物的病蟲害防治以及蓄禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中傳染病的防治方面,芽孢桿菌及其抗菌物質(zhì)展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。利用芽孢桿菌尤其是枯草芽孢桿菌進行生物防治或者生產(chǎn)微生物殺菌劑以代替劇毒化學(xué)藥品是一種可行的策略。

    參考文獻:

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    [2] 石春芝、陶天中、岳瑩玉,神農(nóng)架自然保護區(qū)大九湖芽孢桿菌資源調(diào)查[J],氨基酸和生物科學(xué),2003

    [3] 南慶賢、戴瑞彤,中國肉制品微生物安全問題[J],肉類研究,2004

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    [6] 鐘青萍,納豆菌及其抗菌蛋白的研究,博士論文:南昌大學(xué)博士論文,2001

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