QuECHRS結(jié)合UPLC-MS/MS法測定水產(chǎn)品中酰胺醇類抗生素殘留及基質(zhì)效應(yīng)

李麗春，劉書貴，尹怡，鄭光明，馬麗莎，戴曉欣，單奇，趙城，王景鑫

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(廣州)，農(nóng)業(yè)部休閑漁業(yè)重點實驗室，廣州 510380)

酰胺醇類藥物是水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用的一類廣譜性抗菌治療藥物，主要包括氯霉素(chloramphenicol, CAP)，甲砜霉素(thiamphenicol,TAP)和氟苯尼考(florfenicol,FF)。其中CAP因具有較強的毒副作用，可引起致命的灰嬰綜合征和再生障礙性貧血癥[1-2]。因此中國及歐盟等國家和地區(qū)已將CAP列為禁用藥[3]，歐盟規(guī)定CAP在水產(chǎn)品中的最高殘留限量(MRL)為0.3 μg/kg，隨著CAP在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的禁用，TAP和FF因抗菌譜廣、吸收迅速且無交叉耐藥性等特點[4]，已成為了CAP的主要替代藥物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛用于淡水魚類細菌性病害的治療用藥。歐盟(EEC)96/23 公告和中國農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定TAP和FF在動物性食品中最高殘留限量分別為50和1 000 μg/kg[5-6]。

近年來關(guān)于抗生素殘留的公眾事件給水產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)。隨著檢測技術(shù)的不斷更新，高靈敏度、高準(zhǔn)確性、快速便捷和環(huán)境友好的檢測方法是目前檢測分析的趨勢。因此有必要建立更準(zhǔn)確、快速和穩(wěn)定檢測的水產(chǎn)品中酰胺醇類抗生素殘留的方法。

目前水產(chǎn)品等動物性組織中酰胺醇類的檢測方法報道的較多，常用且可定量的主要有高效液相色譜法(HPLC)[7-11]、氣相色譜法(GC)[12-19]、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)[20-22]、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS/MS)[23-26]和超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-MS/MS)[27-29]等。但上述方法的前處理過程比較復(fù)雜，所需時間較長和材料較復(fù)雜，大多需要經(jīng)過提取、凈化和濃縮。而前處理過程越復(fù)雜其過程損耗越大，因此適當(dāng)?shù)販p少處理步驟可提高其檢測靈敏度。此外，前期研究大多未考慮基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響。針對上述情況，本研究基于QuECHERS前處理技術(shù)建立水產(chǎn)品中酰胺醇類抗生素殘留的快速準(zhǔn)確的檢測方法，同時采用提取后加標(biāo)法評價目標(biāo)物濃度和基質(zhì)濃度對基質(zhì)效應(yīng)的影響，以期建立更加準(zhǔn)確、穩(wěn)定且靈敏度較高的酰胺醇類抗生素的快速檢測方法，為水產(chǎn)品中酰胺醇類抗生素殘留分析的準(zhǔn)確測定提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

主要包括：甲醇為色譜純，購買于Burdick & Jackson 公司(USA)；甲酸和乙酸為色譜純，購于美國Fisher公司；N-丙基乙二胺(PSA)和C18為分析純，購于CNW 公司(USA)；氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)、氟苯尼考(FF)和氘代氯霉素(CAP-D5)標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)購于德國Dr.Ehrenstorfer公司；氯化鈉和無水硫酸鎂為分析純，購于廣州化學(xué)試劑廠；實驗用水為超純水。實驗所用草魚購于廣州市荔灣區(qū)西塱水產(chǎn)品市場。

1.2 儀器和設(shè)備

主要包括：Waters UPLC-Xevo TQD MS/MS超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，旋渦混勻器(德國IKA公司)，超純水機(美國Millipore公司)，離心機(上海安亭公司)，氮吹儀(美國Organomation公司)和高速離心機(美國Sigma公司)以及其他實驗室常用器皿。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取CAP、TAP和FF標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別移取上述單標(biāo)儲備液0.1 mL， 用甲醇定容于同一10 mL的容量瓶中，配制成10.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。移取100 μg/mL

CAP-D5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL用甲醇定容于10 mL容量瓶內(nèi)，配制成質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)中間溶液，采用系列稀釋法配制成100.00 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液均于-18 ℃下避光保存。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱為Waters (Wexford, Ireland) Acquity UPLC BEH C18(2.1×100 mm i.d., 1.7 μm particle size)，色譜柱溫度為40 ℃；流動相A為甲醇，流動相B為水；流速為0.20 mL/min；進樣體積為10 μL，梯度洗脫程序列于表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Workflow of gradient elution

注：A為甲醇，B為水。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源為大氣壓電噴霧離子源負離子模式(ESI-)；離子傳輸毛細管溫度為350 ℃；離子源溫度為150 ℃；去溶劑氣流速為650 L/h，錐孔流速為50 L/h，掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 酰胺醇類化合物的MRM參數(shù)Tab.2 MRM parameters of amphenicols

注：帶“*”為定量離子。

1.5 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取草魚肌肉樣品5.00 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管中，加入100.00 ng/mL CAP-D5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液50 μL，然后加入10 mL 0.1%甲酸酸化的乙腈、3 g無水硫酸鎂和2 g氯化鈉，同時加入150 mg PSA和300 mg 中性氧化鋁。渦旋提取1 min，5 000 r/m離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL玻璃離心管中，剩余殘渣用10 mL 0.1%甲酸酸化乙腈重復(fù)提取一次，合并上清液于40 ℃下氮氣吹干，1 mL甲醇水(1∶1，V/V)定容，過0.22 μm濾膜，待UPLC-MS/MS測定。

1.6 基質(zhì)效應(yīng)評價

基質(zhì)效應(yīng)主要指試樣中的非待測組分影響待測物濃度或質(zhì)量測定的準(zhǔn)確度，引起待測物響應(yīng)值增加或減少的現(xiàn)象[30-33]。

任何一種物質(zhì)的檢測都不可避免基質(zhì)效應(yīng)的影響[34]，在液相色譜質(zhì)譜中，由于基質(zhì)中的非揮發(fā)性組分與待測物質(zhì)在霧滴表面離子化的過程中發(fā)生競爭，影響電噴霧接口處的離子化效率，非揮發(fā)性的基質(zhì)組分將霧滴吸引在一起，阻止其裂解成更小的微滴。LC-MS的檢測限、線性、準(zhǔn)確度和精密度均受到基質(zhì)效應(yīng)的影響，因此在LC-MS分析時必須考慮基質(zhì)效應(yīng)[35]。

水產(chǎn)品中蛋白質(zhì)和脂肪等雜質(zhì)較復(fù)雜，容易引起基質(zhì)效應(yīng)。研究表明,樣品提取方法[36]、固相萃取凈化[37]、同位素標(biāo)記[38-39]和基質(zhì)中磷脂含量等對基質(zhì)效應(yīng)均有一定影響。為了確保水產(chǎn)品中酰胺醇類抗生素檢測的準(zhǔn)確性，本研究對QuECHERS結(jié)合UPLC-MS/MS法測定水產(chǎn)品中酰胺醇類抗生素殘留量的基質(zhì)效應(yīng)進行研究，為減弱或補償其殘留測定中的基質(zhì)效應(yīng)提供理論依據(jù)，同時也為酰胺醇類抗生素在水產(chǎn)品中的準(zhǔn)確定量分析等提供技術(shù)支持。

在建立的前處理方法和色譜測定條件下，測定空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛饶繕?biāo)物的響應(yīng)強度，通過二者目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比的相對比值評價基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)[40]，計算公式見式(1)。

式(1)

式(1)中：ME為基質(zhì)效應(yīng)值，Am為基質(zhì)中待測物質(zhì)峰面積，Ami為基質(zhì)中內(nèi)標(biāo)物峰面積，As為溶劑中待測物質(zhì)峰面積，Asi為溶劑中內(nèi)標(biāo)物峰面積。

如果ME>1.0，說明基質(zhì)對目標(biāo)化合物具有增強響應(yīng)強度的作用；如果ME<1.0，說明基質(zhì)對目標(biāo)化合物具有抑制其響應(yīng)強度的作用；如果ME=1.0，則說明基質(zhì)對目標(biāo)化合物無影響；ME偏離1.0程度越大說明基質(zhì)效應(yīng)越強，ME越接近1.0，則表明基質(zhì)效應(yīng)越小[41-45]。

1.7 實際樣品的測定及風(fēng)險分析

從廣東佛山環(huán)球水產(chǎn)品批發(fā)市場和廣州市黃沙水產(chǎn)品批發(fā)市場共采集生魚樣品20份，每份樣品采集鮮魚4尾，每尾不低于1.0 kg，采用本研究建立的前處理方法和色譜條件對市場采集的鮮魚樣品中3種酰胺醇類抗生素殘留量進行測定，并根據(jù)現(xiàn)行限量標(biāo)準(zhǔn)對采集的樣品進行風(fēng)險分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法線性、檢測限和定量限

采用系列稀釋法配制質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中含有CAP-D5內(nèi)標(biāo)5.0 ng/mL。按照本方法建立的色譜條件進行測定，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比為縱坐標(biāo)y，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，獲得其線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(表3)。TAP在0.5～100.0 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r大于0.999 9；CAP和FF在0.1～100.0 ng/mL范圍內(nèi)線性較好，相關(guān)系數(shù)r大于0.999 8。

圖1 氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)曲線圖Fig.1Calibration curves of CAP, TAP and FF

在空白基質(zhì)樣品中添加3種抗生素后,以性噪比(S/N)等于3和10分別計算方法中化合物的檢測限(LOD)和定量限(LOQ)[46]。3種酰胺醇類抗生素的LOD為0.10～0.50 μg/kg，LOQ為0.50～1.00 μg/kg，結(jié)果見表3。

2.2 加標(biāo)回收率和精密度

按照本方法的前處理方法和色譜條件，以不含CAP、TAP和FF的草魚為基質(zhì)，采用基質(zhì)加標(biāo)的方法評價了1.0、5.0和10.0 μg/kg 3個含量水平的加標(biāo)回收率和精密度，每個含量水平設(shè)置6個重復(fù)，結(jié)果見表4。

表3 3種抗生素線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限和定量限Tab.3 Linear equation, correlation, LOD and LOQ for 3 antibiotics

表4 3種抗生素在草魚肌肉樣品中的加標(biāo)回收率和精密度Tab.4 Average recoveries and precisions for 3 antibiotics in carp muscle n=6

結(jié)果表明，3種酰胺醇類抗生素的加標(biāo)回收率在(84.5±4.64)%～(106.1±8.69)%之間，日內(nèi)精密度在3.17%～9.74%之間，日間精密度在2.26%～7.90%之間。酰胺醇類抗生素的殘留檢測方法大多都采用提取后再凈化的方法[47-48]，還有采用固相萃取柱凈化的方法[49-50]，而本研究的前處理方法簡單快捷，提取和凈化同時進行，且回收率和精密度較好，滿足國內(nèi)外對水產(chǎn)品中酰胺醇類抗生素殘留檢測的要求。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

2.3.1 目標(biāo)分析物濃度對基質(zhì)效應(yīng)的影響

采用提取后加標(biāo)法，分析了目標(biāo)分析物濃度(0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 ng/mL)對基質(zhì)效應(yīng)的影響，每個質(zhì)量濃度設(shè)置6個重復(fù)。

圖2 目標(biāo)分析物濃度對基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.2 The effect of target analytes concentrationson matrix effect

基質(zhì)效應(yīng)大小與基質(zhì)中目標(biāo)分析物濃度有一定相關(guān)性。據(jù)文獻報道，高濃度水平基質(zhì)效應(yīng)低于低濃度水平[51-52]。CAP、TAP和FF的濃度對基質(zhì)效應(yīng)有一定影響，隨目標(biāo)物濃度的減小，基質(zhì)效應(yīng)值也隨之減小，呈現(xiàn)出高濃度基質(zhì)增強，低濃度基質(zhì)抑制的趨勢(圖2)。其中CAP的基質(zhì)效應(yīng)在(0.661±0.127)～(1.096±0.087)之間，其受目標(biāo)物濃度變化的影響較TAP和FF平緩；在1.0～100.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的CAP的ME在(0.965±0.040)～(1.096±0.087)之間，在樣品測定時在此范圍內(nèi)可忽略基質(zhì)效應(yīng)的影響。但是在1.0 ng/mL以下則存在較強的基質(zhì)抑制效應(yīng)，建議檢測定量低濃度的CAP時要考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響。

TAP在5.0～100.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)存在較強的基質(zhì)增強效應(yīng)，其基質(zhì)效應(yīng)在(1.219±0.028)～(1.737±0.039)之間，在5.0 ng/mL以下則存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，且濃度越低基質(zhì)抑制效應(yīng)越強。FF在20.0 ng/mL質(zhì)量濃度以上時存在基質(zhì)增強效應(yīng)，在5.0 ng/mL以下時存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，且隨濃度降低增強。因此，在檢測酰胺醇類抗生素殘留時，除CAP檢測質(zhì)量濃度在1.0～100.0 ng/mL范圍內(nèi)不需要考慮基質(zhì)效應(yīng)外，其他化合物均要考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響。綜上，在實際檢測中，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量，可提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.3.2 基質(zhì)濃度對基質(zhì)效應(yīng)的影響

本研究采用提取后加標(biāo)法分析了基質(zhì)濃度對基質(zhì)效應(yīng)的影響，按照上述前處理方法，分別取2.0、5.0和10.0 g樣品，經(jīng)提取凈化后用20.0 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(其中CAP-D5質(zhì)量濃度為10 ng/mL)定容至1 mL，獲得基質(zhì)濃度分別為2.0、5.0和10.0 g/mL，待測物濃度為20.0 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用上述儀器條件進行測定。

圖3 基質(zhì)濃度對基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.3 The effects of matrix concentrations on matrix effects

結(jié)果表明，基質(zhì)濃度對檢測結(jié)果有較大影響，隨著基質(zhì)濃度的增加，基質(zhì)效應(yīng)從基質(zhì)增強變?yōu)榛|(zhì)抑制，且CAP的基質(zhì)效應(yīng)較TAP和FF低，其基質(zhì)效應(yīng)為(0.843±0.038)～(1.004±0.071)(圖3)?；|(zhì)濃度在5.0 g/mL時3種抗生素的基質(zhì)效應(yīng)較小，分別是CAP為(0.941±0.061)，TAP為(0.981±0.063)，F(xiàn)F為(0.948±0.050)?；|(zhì)濃度為10.0 g/mL時3種抗生素均存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，而在2.0 g/mL時TAP和FF存在較強的基質(zhì)增強效應(yīng)，其基質(zhì)效應(yīng)分別為(1.676±0.100)和(1.513±0.069)。李麗春等[53]的研究也表明基質(zhì)濃度對基質(zhì)效應(yīng)有一定影響，因此在測定水產(chǎn)品中酰胺醇類抗生素殘留時應(yīng)考慮檢測樣品的取樣量，并采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量校準(zhǔn)，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 實際樣品測定及風(fēng)險分析

采用本方法對市售的20份鮮魚樣品進行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4份檢出TAP，其質(zhì)量濃度為2.26～9.57 μg/kg；FF檢出17份，檢出濃度為1.34～33.27 μg/kg。根據(jù)中國農(nóng)業(yè)部235號公告中規(guī)定FF殘留限量為1 000 μg/kg，實驗所涉及的所有樣品均未超過限量標(biāo)準(zhǔn)。而TAP在日本肯定列表中規(guī)定鱸形目殘留限量為20 μg/kg，所有檢出樣品均未超過限量要求。

3 結(jié)論

本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)對水產(chǎn)品中3種酰胺醇類抗生素的殘留量進行定量測定，樣品基質(zhì)經(jīng)0.1%甲酸酸化的乙腈提取，同時加入PSA和中性氧化鋁用于凈化除雜，用甲醇水(1∶1，V/V)定容后UPLC-MS/MS測定，通過基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法減弱其基質(zhì)效應(yīng)。CAP和FF在0.1～100.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)0.999 8～0.999 9；TAP在0.5～100.0 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。CAP和FF的LOD和LOQ分別為0.10 μg/kg和0.50 μg/kg；TAP的LOD為0.50 μg/kg，LOQ為1.00 μg/kg。3種酰胺醇類抗生素在1.0、5.0和10.0 μg/kg 3個添加水平下的日內(nèi)平均回收率為(86.60±5.62)%～(106.10±8.69)%，日內(nèi)精密度為3.17%～9.74%；日間加標(biāo)回收率為(84.50±4.64)%～(103.00±8.17)%，日間精密度為2.26%～7.90%。該方法LOD和LOQ滿足國內(nèi)外水產(chǎn)品中酰胺醇類抗生素殘留測定的要求，日內(nèi)和日間加標(biāo)回收率和精密度好。該方法前處理簡便快捷、靈敏度、重復(fù)性且準(zhǔn)確性較好，可用于水產(chǎn)品中3種酰胺醇類抗生素殘留的定量測定。

采用QuECHERS結(jié)合UPLC-MS/MS法測定水產(chǎn)品中酰胺醇類抗生素時，基質(zhì)效應(yīng)對目標(biāo)分析物濃度的測定有影響，且基質(zhì)濃度對基質(zhì)效應(yīng)也有影響。其中CAP的基質(zhì)效應(yīng)較TAP和FF小，其基質(zhì)效應(yīng)為(0.661±0.127)～(1.096±0.087)；且在1.0～100.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)的基質(zhì)效應(yīng)為(0.965±0.040)～(1.096±0.087)，而在1.0 ng/mL以下則存在較強的基質(zhì)抑制效應(yīng)，建議檢測定低濃度(<1.0 ng/ml)的CAP時考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響。TAP在5.0～100.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)存在較強的基質(zhì)增強效應(yīng)。FF在20.0 ng/mL質(zhì)量濃度以上時存在基質(zhì)增強效應(yīng)，而在5.0 ng/mL以下時存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，且隨濃度降低基質(zhì)抑制效應(yīng)增強。同樣基質(zhì)濃度對檢測結(jié)果也有較大影響，隨著基質(zhì)濃度的增加，基質(zhì)效應(yīng)從基質(zhì)增強變?yōu)榛|(zhì)抑制。因此，在測定水產(chǎn)品中酰胺醇類抗生素殘留時應(yīng)對其基質(zhì)效應(yīng)進行考察，并采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量校準(zhǔn)，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。