轉(zhuǎn)染人血管內(nèi)皮生長因子基因的組織工程骨修復(fù)眼眶壁骨缺損的實驗研究

肖彩雯 范先群 周慧芳 畢曉萍 沈 琴 王業(yè)飛

轉(zhuǎn)染人血管內(nèi)皮生長因子基因的組織工程骨修復(fù)眼眶壁骨缺損的實驗研究

肖彩雯 范先群 周慧芳 畢曉萍 沈 琴 王業(yè)飛

目的探討以轉(zhuǎn)染人血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF）基因的骨髓基質(zhì)干細胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）構(gòu)建的組織工程骨在犬眼眶壁骨缺損中的修復(fù)效果。方法體外分離擴增犬自體BMSCs至第2代，用腺病毒轉(zhuǎn)染VEGF基因。采用Real－time PCR和Western Blot檢測目的基因和蛋白表達情況。細胞接種在珊瑚支架材料上構(gòu)建組織工程骨，Elisa檢測轉(zhuǎn)基因細胞在支架材料上的蛋白持續(xù)表達情況。成年比格犬24只，雙側(cè)眼眶內(nèi)側(cè)壁制造直徑12 mm圓形骨缺損模型，隨機分為4組：A組植入轉(zhuǎn)染VEGF的組織工程骨，B組植入未轉(zhuǎn)染基因的組織工程骨，C組植入單純珊瑚材料，D組為曠置組。分別在手術(shù)后4周、12周、24周取材，行大體觀察、Micro－CT分析、免疫組化方法檢測血管形成情況，以及組織學(xué)觀察和組織形態(tài)學(xué)檢測比較骨缺損修復(fù)效果。結(jié)果VEGF基因修飾的BMSCs能夠高表達目的基因和蛋白，構(gòu)建組織工程骨后能夠在體外持續(xù)分泌VEGF蛋白22 d。C組和D組均未修復(fù)眶壁骨缺損。A組在骨缺損修復(fù)過程中，4周時的新生血管形成量和新生骨體積明顯高于B組（P＜0.05），但12周、24周時兩組的新生血管量和新生骨量均無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論轉(zhuǎn)染VEGF的BMSCs構(gòu)建的組織工程骨體內(nèi)回植后早期能夠促進新生血管形成，加速新骨生成。

血管內(nèi)皮生長因子骨髓基質(zhì)干細胞組織工程骨血管化眶壁骨缺損

骨組織工程以生長因子、種子細胞和載體支架為基礎(chǔ)，模擬了體內(nèi)骨再生的過程。近年來，大量動物實驗證實，組織工程骨能夠修復(fù)或部分修復(fù)多種部位的骨缺損，展示了其臨床應(yīng)用的美好前景。但組織工程骨植入體內(nèi)后，距離毛細血管200 μm以上的細胞將因為缺乏養(yǎng)分和氧氣而不能存活[1]，影響了組織工程骨的體內(nèi)存活率，無法滿足臨床治療的需求。如能實現(xiàn)組織工程骨的早期血管化，種子細胞將能盡早獲得營養(yǎng)供應(yīng)，從而可使更大體積的組織工程骨得以存活進而修復(fù)缺損。因此，促進組織工程骨血管化的研究越來越引起人們的關(guān)注。

血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種血管內(nèi)皮細胞特異性有絲分裂原，存在5種不同形式，分別由121、165、145、189和206個氨基酸組成。其中VEGF 165以可溶性的形式存在，或與細胞膜、基底膜或細胞外基質(zhì)含有肝素的糖蛋白結(jié)合，是人體內(nèi)主要的分泌形式和效應(yīng)分子。由于VEGF在體外能促進內(nèi)皮細胞生長，在體內(nèi)可誘導(dǎo)血管發(fā)生[2]，因此本實驗利用體外轉(zhuǎn)基因技術(shù),將VEGF 165基因?qū)肴撬杌|(zhì)干細胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）,使之穩(wěn)定表達和分泌VEGF。然后以轉(zhuǎn)基因的自體BMSCs為種子細胞，構(gòu)建組織工程骨，回植體內(nèi)修復(fù)眶內(nèi)側(cè)壁標準骨缺損，觀察其能否通過加速血管形成促進骨缺損的修復(fù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

α－MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、小牛血清購自美國Gibco公司，VEGF 165腺病毒表達載體（Ad－VEGF）和攜帶β－半乳糖酐酶基因的腺病毒對照載體（Ad－Lacz）由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院骨科實驗室構(gòu)建成功。通過感染293細胞擴增病毒,病毒噬菌斑形成試驗測定滴度。

圖1 實驗所用珊瑚材料的大體觀察（A）、Micro-CT三維重建圖像（B）和電鏡照片（C）

支架材料（天然珊瑚多孔材料）購自北京創(chuàng)意公司,孔徑250～350 μm，孔隙率＞90%,根據(jù)眼眶內(nèi)側(cè)壁的形狀制成高度為3 mm的圓錐狀（一側(cè)截面直徑為12 mm，另一側(cè)為10 mm）（圖1）。超聲清洗、60Co消毒后備用。

1.2 BMSCs的獲取、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

按照文獻[3]的方法進行BMSCs的獲取、分離、培養(yǎng)和傳代。在第2代細胞融合達到50%～70%后，以重復(fù)感染倍數(shù)（Multiplication of infection，MOI）為150進行病毒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時間為12 h，換液后繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)后24 h用5溴－4氯－3吲哚－β半乳糖苷（X－gal）特異性染色，能產(chǎn)生藍綠色沉淀的細胞為已經(jīng)轉(zhuǎn)染Ad－Lacz細胞?；蜣D(zhuǎn)染24 h和72 h后，分別進行Real－time PCR和蛋白印跡法(Western Blot)檢測目的基因和蛋白表達情況。

1.3 體外構(gòu)建組織工程骨

珊瑚材料預(yù)濕過夜，將轉(zhuǎn)基因的BMSCs制成1×107cells/mL的細胞懸液，將細胞懸液緩慢地從不同側(cè)面滴入珊瑚材料（每塊材料500 μL）,置于CO2培養(yǎng)箱孵育3～4 h后，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每日抽取細胞材料復(fù)合物培養(yǎng)液，Elisa法檢測目的蛋白VEGF分泌情況。材料接種細胞后，1 d、3 d、7 d各取一塊以掃描電鏡觀察細胞在材料上附著生長情況。組織工程骨體外培養(yǎng)5 d后行自體體內(nèi)回植。

1.4 動物分組和手術(shù)方法

成年比格犬24只，雌雄不限，靜脈氯氨酮麻醉，側(cè)臥位。雙側(cè)眼部常規(guī)消毒、鋪無菌巾，切開眶下緣皮膚、分離肌肉、切開眶下緣骨膜，向鼻內(nèi)側(cè)分離暴露眶內(nèi)側(cè)壁。雙側(cè)眼眶內(nèi)側(cè)壁（眶緣內(nèi)0.5 cm）制造直徑12 mm圓形骨缺損模型（圖2），共計48例，隨機分成4組。A組：植入轉(zhuǎn)染VEGF的自體BMSCs構(gòu)建的組織工程骨；B組：植入未轉(zhuǎn)染基因的自體BMSCs構(gòu)建的組織工程骨；C組：植入單純珊瑚組；D組：曠置組（每組n=12）。可吸收縫線縫合眶緣處骨膜，5－0絲線縫合皮膚。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素40萬單位，每日2次。

圖2 缺損模型的制備和缺損修復(fù)

1.5 大體觀察和Micro－CT檢查

分別在手術(shù)后4周、12周、24周各取材8只動物，標本行大體觀察后，采用Micro－CT（瑞士Scanco Medical公司）攝取斷層影像，掃描厚度40 μm，閾值設(shè)置為200 mgHA/cm3（毫克羥基磷灰石/立方厘米），測定并比較標本骨缺損處的新生骨體積之間的差異。

1.6 免疫組化檢測和組織形態(tài)學(xué)測定

所取標本分為對稱的兩部分，一部分以多聚甲醛固定，EDTA脫鈣，脫水，石蠟包埋切片，用抗狗的CD31抗體標記骨缺損區(qū)的新生血管內(nèi)皮細胞。連續(xù)切片（每組織塊5張），每張切片隨機選取5個視野，200倍顯微鏡下計數(shù)微血管數(shù)量，以陽性的單個細胞或一簇細胞作為1個微血管。

另一部分標本乙醇梯度脫水，甲基丙烯酸甲基酯單體包埋，硬組織切片，Van Gieson染色。觀察骨組織形成情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件包進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,兩兩比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs轉(zhuǎn)染后目的基因后生物學(xué)檢測

第2代BMSCs生長至50%～70%融合時，用MOI=150∶1的倍率行基因轉(zhuǎn)染，經(jīng)X-gal特異性染色證實轉(zhuǎn)染效率能達到95%以上。基因轉(zhuǎn)染前后細胞形態(tài)沒有明顯的改變。轉(zhuǎn)染基因后Real-time PCR和Western Blot檢測證實VEGF目的基因和蛋白的表達量均升高（圖3）。

圖3 Real－time PCR（A）和Western Blot（B）檢測目的基因和蛋白的表達情況，可見基因轉(zhuǎn)染組的表達量增高（＊：P＜0.05）

2.2 細胞在材料上的增殖

Elisa證實，細胞接種材料后，BMSCs能持續(xù)22 d穩(wěn)定分泌VEGF目的蛋白(21.52±1.85 ng/106cells/d)。掃描電鏡觀察，細胞接種材料1 d后可見細胞呈成纖維細胞樣黏附于珊瑚表面，均勻分布，細胞伸展良好，有較長突起，珊瑚孔隙中有分泌的細胞外基質(zhì)填充。隨著培養(yǎng)時間的延長，可見珊瑚材料上的細胞數(shù)量與胞外基質(zhì)均明顯增多（圖4）。

圖4 細胞接種材料1 d（A）、3 d（B）、7 d（C）掃描電鏡觀察，可見珊瑚材料上的細胞數(shù)量與胞外基質(zhì)隨時間延長明顯增多

2.3 術(shù)后大體觀察和Micro-CT檢測

實驗動物在術(shù)后的前3 d出現(xiàn)手術(shù)區(qū)組織水腫，1周后水腫基本消退。拆除眼瞼皮膚縫線，皮膚切口愈合良好。實驗期間未見修復(fù)材料排出、移位、傷口感染等局部并發(fā)癥。

圖5 術(shù)后4周、12周、24周取材行Micro－CT檢查和大體觀察

取材時大體觀察，①術(shù)后4周：A組，珊瑚材料部分降解吸收，邊緣與周圍的正常眶骨結(jié)合較緊密，鼻竇面為完整的粘膜覆蓋；B組，材料部分降解，眶內(nèi)側(cè)面形成類白色的骨組織和材料的混合物，鼻竇面形成完整的粘膜；C組，珊瑚材料體積變小，與缺損邊緣形成纖維結(jié)締組織；D組，骨缺損的銳性邊緣變圓鈍，缺損區(qū)為纖維組織填充。②術(shù)后12周：A組，骨缺損周邊形成菲薄的新生骨組織，中央被覆半透明的結(jié)締組織；B組，部分缺損區(qū)內(nèi)新骨形成，部分則為纖維結(jié)締組織，內(nèi)有未降解完全的材料殘余；C組，珊瑚材料大部分吸收，被纖維結(jié)締組織替代；D組，3例鼻竇側(cè)的篩狀骨質(zhì)增生，表面形成白色膜樣結(jié)締組織，1例缺損區(qū)中央變黑，沒有組織覆蓋。③術(shù)后24周：A組，部分骨缺損完全被新生骨替代，但中央?yún)^(qū)為纖維組織；B組，缺損的邊緣新生骨相互連接但不能完全填補骨缺損，中央或偏中央?yún)^(qū)為軟組織；C、D組：缺損大部分為纖維組織所填充，邊緣有少量骨組織形成，下方的篩狀骨增生（圖5）。

Micro－CT檢測，①術(shù)后4周：A組、B組的珊瑚材料部分降解，而C組的材料大部分未降解。②術(shù)后12周：A組材料已完全降解吸收，缺損區(qū)有新生骨組織生成；B組大部分材料已降解，缺損區(qū)部分被新生骨組織填充，C、D兩組的骨缺損邊緣有少量骨組織向中央爬行。③術(shù)后24周：A、B組大部分缺損為骨組織修復(fù)，但中央?yún)^(qū)域仍未修復(fù)；而C、D兩組則表現(xiàn)為骨不連（圖5）。

對比新生骨組織的體積，A組（16.38±1.66 mm3）在4周時顯著高于B組（9.34±2.02 mm3）（P＜0.05），在12周、24周時差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而在各檢測時間點，A、B組的新生骨量均遠多于C、D組。

2.4 免疫組化和組織形態(tài)學(xué)檢測

用抗狗的CD31標記骨缺損區(qū)的新生血管，免疫組化檢測可見新生血管呈棕色圓環(huán)狀，血管內(nèi)的紅細胞非特異性顯示為淺棕色。4周時血管數(shù)量計數(shù)，A組為（20.5±2.65），大于B組的（13.5±2.38）（P＜0.05）（圖6）。12周、24周時兩組的新生血管數(shù)目則無統(tǒng)計學(xué)差異。而在各檢測時間點，A、B組的新生血管數(shù)量均遠大于C、D組（P＜0.05）。

圖6 免疫組化染色可見轉(zhuǎn)染VEGF組（A）有大量的血管生成，而未轉(zhuǎn)染組（B）血管形成量明顯減少

組織學(xué)檢查可見：A、B組4周時有類骨質(zhì)圍繞珊瑚材料形成，12周時有大量編織骨形成和生長活躍的骨細胞，新生骨和散在的尚未降解的珊瑚微粒并存；24周時珊瑚完全降解消失，新生骨的結(jié)構(gòu)發(fā)生改建，有哈佛氏系統(tǒng)形成。但兩組的新生骨均未能完全修復(fù)骨缺損。C組4周時缺損區(qū)大部分為珊瑚材料，僅在骨缺損邊緣見到少量類骨質(zhì)向材料內(nèi)部生長；12周時，珊瑚材料大部分降解，缺損邊緣有少量新生骨組織，而中央篩竇側(cè)骨質(zhì)增生；24周時，材料全部降解，骨缺損未修復(fù)。D組4周時骨缺損處為空白，12周時骨缺損下方的鼻竇粘膜基本覆蓋缺損（篩狀鼻竇有少量新生骨組織生成），24周時缺損中央仍為空白區(qū)域（圖7）。

圖6 轉(zhuǎn)染VEGF基因的組織工程骨術(shù)后組織學(xué)檢查

3 討論

隨著交通事故的增多，眼眶外傷所致的眼眶骨缺損的發(fā)病率正在逐年上升。眼眶骨缺損不僅會導(dǎo)致顱頜面部畸形，而且會造成眼球移位、視功能障礙。自體骨移植一直被認為是眼眶骨缺損修復(fù)的金標準[4]。但移植自體骨時會導(dǎo)致供區(qū)缺損，而且不能塑形，很難精確地重建眼眶[5]。目前臨床常用的修復(fù)方法是將修復(fù)材料橋架在骨缺損部位之上，但材料存在感染和排異的隱患。

本研究試圖將組織工程技術(shù)引入眼眶壁的修復(fù)重建中，其目的是促進缺損區(qū)的新生骨組織生成，達到真正的形態(tài)和功能的修復(fù)。但是眼眶骨缺損的修復(fù)過程不同于其他部位，眼眶骨缺損處的骨膜也易受到損傷，或隨骨折片陷入副鼻竇或逐漸萎縮、纖維化，造成該部位的血液供應(yīng)很差。該部位一面是眶內(nèi)的軟組織，另一面是副鼻竇的竇腔。而在副鼻竇粘膜完全修復(fù)之前，竇腔側(cè)的細胞很難獲得營養(yǎng)供應(yīng)。因此，解決組織工程骨的血管化問題成為決定組織工程骨能否修復(fù)眼眶壁骨缺損的關(guān)鍵因素。

目前促進組織工程骨血液供應(yīng)的方法主要有：①血管束移植：利用顯微外科技術(shù)，植入帶血管蒂的筋膜瓣或帶血管束的組織工程骨；②應(yīng)用生長因子，如VEGF促進血管生長；③血管內(nèi)皮細胞聯(lián)合成骨細胞與支架材料復(fù)合。預(yù)構(gòu)血管化的組織工程骨還處于研究階段，尚不能有效供給種子細胞營養(yǎng)物質(zhì)。大量研究證明，VEGF能有效地促進血管生長[2，6－7]。因此，本實驗試圖通過提高VEGF的水平來促進組織工程骨的血管化進程，進一步觀察血管化的提高是否能促進眼眶部位的骨組織修復(fù)。

VEGF在體內(nèi)的生物半衰期短暫，靜脈輸入時半衰期僅為3～6 min，遠遠短于產(chǎn)生效應(yīng)所需的時間，無法達到持久、穩(wěn)定、有效的血管生成作用。利用基因工程方法將各種生長因子基因轉(zhuǎn)入細胞,能夠在特定時間內(nèi)長期分泌生長因子，可有效地促進血管的再生。因此采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將VEGF基因轉(zhuǎn)入骨組織工程的種子細胞中，有可能為血管化組織工程骨的構(gòu)建與應(yīng)用提供新的方法與思路。我們通過將自體的BMSCs轉(zhuǎn)染VEGF，使之在體外能高表達目的蛋白；回植體內(nèi)后免疫組化檢測到轉(zhuǎn)染組在早期確實形成了更多的新生血管，證實通過基因轉(zhuǎn)染的方式能夠增強組織工程骨的早期血管化的能力。

研究表明，阻斷內(nèi)源性VEGF的活性，骨形成與骨吸收就將終止[8]。Street等[9-10]通過受體阻斷成骨細胞分泌的VEGF，能阻止骨組織的修復(fù)，外源性加強VEGF后，能明顯促進骨組織的愈合。本研究發(fā)現(xiàn)，4周時基因轉(zhuǎn)染組新生血管數(shù)量和新生骨量均多于未轉(zhuǎn)染組，表明在轉(zhuǎn)基因組的早期成骨能力得到提高，經(jīng)VEGF基因轉(zhuǎn)染修飾的BMSCs表達的VEGF可通過自分泌方式發(fā)揮強大的生物學(xué)效應(yīng)，促進局部血管生成，為成骨提供更有利的微環(huán)境，增強成骨活性；在12周和24周時，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染基因組和未轉(zhuǎn)染組的新生血管量和新生骨量沒有明顯的差別，考慮可能有以下原因：①我們通過復(fù)制缺陷性腺病毒將VEGF 165基因轉(zhuǎn)染入BMSCs，目的基因未整合到染色體內(nèi)，目的蛋白的表達時間相對較短。同時腺病毒載體構(gòu)建組織工程骨植入體內(nèi)后有可能刺激機體的免疫系統(tǒng)，加速轉(zhuǎn)基因細胞的吞噬，致使目的蛋白表達時間進一步縮短。因此，12周和24周時外源基因沒有得到加強，成骨能力和未轉(zhuǎn)染基因組不再存在差別。②血管形成是一個復(fù)雜的過程，新生血管在VEGF的刺激下形成了較多的新生血管，但隨著VEGF的表達量減少，部分新生血管逐漸萎縮，所以在12周和24周檢測血管的數(shù)量并沒有差別。

本實驗方法早期能夠促進新生血管和新生骨的形成，但長期效果并不明顯，有待進一步研究。

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VEGF Gene Transfected Human BMSCs Acting as Seeding Cell for Tissue Engineering Bond in Orbital Wall Bone Defects

XIAO Caiwen,FAN Xianqun,ZHOU Huifang,BI Xiaoping,SHEN Qin,WANG Yefei.
Department of Ophthalmology, Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:FAN Xianqun.

ObjectiveTo investigate the effect VEGF－gene transfected BMSCs to construct tissue engineered bone in the treatment of orbital wall bone defects.MethodsIn vitro isolated and expanded BMSCs of passage 2 were transfected with adenoviruses containing human VEGF gene,and the target gene expression was evaluated by Real－time PCR and Western Blot.BMSCs were harvested and seeded into the coral scaffolds to construct tissue engineered bone.VEGF protein secretion from the cells was detected using Elisa method.Bilateral orbital wall circular defects(12 mm in diameter)were created in 24 adult beagles dogs.The dogs were divided into 5 groups,the group trasfected by VEGF(Group A),the non－transfected group (Group B),the group implanted coral alone(Group C),and blank group(Group D).Animals were sacrificed at 4,12 and 24 weeks post－implantation,and the repairing effect was evaluated by gross observation,Micro－CT,immunohistochemistry,and histomorphometric analysis.ResultsVEGF gene expression was regulated after gene transfection,and protein secretion was detected 22 days after cell seeding.No repair was found in Groups C and D.The number of new blood vessel and volume of new bone were significantly higher in Group A than in Group B at 4 weeks after implantation(P＜0.05),but no statistically significant at 12 and 24 weeks(P＞0.05).ConclusionTissue－engineered bone composed of VEGF－expressing BMSCs could enhance the formation of blood vessel and bone at early periods in vivo.

Vascular endothelial growth factor;Bone marrow stromal cells;Tissue engineered bone;Vascularity; Orbital wall bone defect

Q813.1+2，R687.3+4

A

1673－0364（2009）－02－0065－05

2009年1月23日；

2009年3月1日)

10.3969/j.issn.1673－0364.2009.04.002

上海市重點學(xué)科建設(shè)項目（S30205），上海交通大學(xué)博士創(chuàng)新基金（BXJ0826），上海市自然科學(xué)基金（08zr1412900）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院眼科。

范先群。