血小板裂解物支持人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的擴(kuò)增

樓 曉 汪勁松 靳繼德 何梓銘 吳祖澤 郭子寬

·論著·

血小板裂解物支持人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的擴(kuò)增

樓 曉 汪勁松 靳繼德 何梓銘 吳祖澤 郭子寬

目的探討血小板裂解物體外培養(yǎng)、擴(kuò)增人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的可行性。方法將富含血小板血漿以凍融裂解法處理，培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；體系中加入不同濃度的裂解物，MTT法檢測細(xì)胞體外增殖情況；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型特征，并應(yīng)用細(xì)胞化學(xué)染色法觀察細(xì)胞體外成骨和成脂肪能力。結(jié)果血小板裂解物培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞呈典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，均一呈現(xiàn)CD14、CD31、CD34、CD45及HLA-DR陰性和CD73、CD90、CD105、CD166陽性，具備體外成骨、成脂分化能力。此外，與經(jīng)篩選的胎牛血清比較，低濃度血小板裂解物即具有支持骨髓基質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增的能力。結(jié)論血小板裂解物可替代胎牛血清，用于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。

骨髓基質(zhì)細(xì)胞血小板細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增

骨髓基質(zhì)細(xì)胞（Mesenchymal stromal cells, MSCs）是一種主要存在于骨髓的未分化多能細(xì)胞，具有分化為多種結(jié)締組織細(xì)胞的潛能，包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肌腱細(xì)胞等[1]。越來越多的證據(jù)表明，MSCs是再生醫(yī)學(xué)和組織工程研究中的重要種子細(xì)胞。由于直接從體內(nèi)獲取的MSCs數(shù)量很低，無法滿足臨床治療要求，所以必須進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。目前，國內(nèi)外臨床級別MSCs的擴(kuò)增體系，多含有經(jīng)過篩選的牛血清為主要營養(yǎng)支持物[2]。將這種體系應(yīng)用于臨床試驗，增加了人畜共患病和異種免疫反應(yīng)的風(fēng)險[1]。因此，我們將處理后的富血小板血漿用于MSCs的培養(yǎng)擴(kuò)增，探討能否使其替代胎牛血清成為新的MSCs培養(yǎng)支持物。

1 材料與方法

1.1 血小板裂解物的制備

富血小板血漿由全軍采供血中心制備。收集5人份的ACD-A抗凝CS 3 000 Plus機(jī)采血小板，每份20 mL。混勻后直接于-80℃和37℃反復(fù)凍融3次，稱為血小板裂解物（Platelet lysates,PL）。900 g離心30 min取上清，分裝凍存于-80℃冰箱備用。

1.2 人MSCs的分離培養(yǎng)

從5名體檢合格的正常骨髓捐獻(xiàn)者采髓獲取10 mL肝素抗凝無菌骨髓血混合液。將骨髓有核細(xì)胞稀釋為1.0×107cells/mL，淋巴細(xì)胞分離液密度離心。吸取中間白膜層，計數(shù)后按2.0×105cells/cm2的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37℃、5%CO2、飽和濕度溫箱中貼壁培養(yǎng)。培養(yǎng)體系為含10%胎牛血清（Stemcell公司）的α-MEM培養(yǎng)液。每周2次換液，細(xì)胞融合接近90%時，以0.05%胰蛋白酶消化傳代。第3代細(xì)胞按實驗分組采用不同的培養(yǎng)體系。

1.3 細(xì)胞增殖能力測定

將第3代細(xì)胞以1.5×103個/孔接種于平底96孔板內(nèi)，每孔200 μL的不同培養(yǎng)體系（10%FBS、5% PL），復(fù)孔為3，均設(shè)平行對照孔和空白調(diào)零孔，將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)72 h。然后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。

1.4 MSCs細(xì)胞表型的流式分析

光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定。取1.25%PL培養(yǎng)的第5代接近融合的MSCs，用0.05%胰蛋白酶消化，計數(shù)后取2×106個細(xì)胞，分裝8管，每管加入10 μL熒光素標(biāo)記的小鼠抗人抗CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CD166及HLA-DR單克隆抗體，另設(shè)2管為空白對照。室溫避光反應(yīng)30 min后，PBS洗滌2次，加入500 μL PBS混勻細(xì)胞。流式細(xì)胞儀（FACScalibur）收集數(shù)據(jù)，Winmdi 29軟件分析細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.5 成骨分化的定向誘導(dǎo)與鑒定

將1.25%PL培養(yǎng)的第5代MSCs，按1×104個/孔接種于24孔培養(yǎng)板，每孔加入0.5 mL完全培養(yǎng)基（含2.5%PL），貼壁24 h之后替換成0.5 mL新的成骨誘導(dǎo)體系（地塞米松0.1 μmol/L、β-甘油磷酸鈉鹽10 mmol/L、抗壞血酸磷酸鹽50 μmol/L），每3天全量換液。培養(yǎng)第2周，按堿性磷酸酶檢測試劑盒操作步驟進(jìn)行堿性磷酸酶染色。

1.6 成脂分化的定向誘導(dǎo)與鑒定

將1.25%PL培養(yǎng)的第5代MSCs，按1×104個/孔接種于24孔培養(yǎng)板，每孔加入0.5 mL完全培養(yǎng)基（含2.5%PL），貼壁24 h之后替換成0.5 mL新的成脂誘導(dǎo)體系（地塞米松1 μmol/L、I BMX 0.5 mmol/L、吲哚美辛100 μmol/L），每3天全量換液。培養(yǎng)第2周，進(jìn)行油紅O染色，鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂肪小滴形成情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD），采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗，P＜0.05為具有統(tǒng)計差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離獲得的骨髓單個核細(xì)胞，接種72 h后鏡下觀察，可見散在分布的貼壁紡錘形細(xì)胞，經(jīng)兩次全量換液后可基本去除非貼壁細(xì)胞。培養(yǎng)7～10 d，細(xì)胞克隆增大，接近80%融合。傳代后的MSCs形態(tài)均一，呈成纖維細(xì)胞樣，排列緊密，生長旺盛，融合密度可達(dá)2.0×104cells/cm2（圖1）。

圖1 經(jīng)含PL培養(yǎng)基培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞形態(tài)觀察（100×）

2.2 細(xì)胞擴(kuò)增效率評價

將1.5×103個/孔接種的MSCs分別以不同體系培養(yǎng)（10%FBS、5%PL），MTT法比較72 h時的細(xì)胞增殖狀況（圖2）。發(fā)現(xiàn)5%PL對MSCs的促增殖作用明顯優(yōu)于10%FBS（P＜0.01）。

2.3 細(xì)胞表型分析

流式細(xì)胞儀分析經(jīng)1.25%PL培養(yǎng)的MSCs表型，表達(dá)CD29、CD73、CD166，陽性率均在95%以上；不表達(dá)CD31、CD34、CD45及HLA-DR。說明所獲得細(xì)胞在細(xì)胞表型上符合MSCs特性，其純度可達(dá)到95%以上（圖3）。

圖2 MTT法比較10%FBS與5%PL培養(yǎng)的MSCs增殖能力

圖3 PL培養(yǎng)的人骨髓MSCs表型特點

2.4 細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化

2.4.1 成骨分化

圖4 MSCs向成骨細(xì)胞的分化（200×）

細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)體系中培養(yǎng)2周之后，多聚甲醛固定，NBT/BCIP染色，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組細(xì)胞漿內(nèi)顯示為藍(lán)色顆粒狀物（圖4A）。對照組細(xì)胞未加誘導(dǎo)劑，堿性磷酸酶染色呈陰性（圖4B）。

2.4.2 成脂分化

定向誘導(dǎo)培養(yǎng)后1周，小部分細(xì)胞內(nèi)已出現(xiàn)微小明亮的脂滴。隨著誘導(dǎo)時間的延長，出現(xiàn)脂滴的細(xì)胞增多，細(xì)胞由梭形變成橢圓形或多角形。培養(yǎng)2周后，脂滴數(shù)目增多、融合。油紅O染色后鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)脂滴呈明亮的橙紅色（圖5）。

圖5 PL培養(yǎng)的MSCs具備體外成脂肪能力

3 討論

MSCs是一群多能的成體干細(xì)胞，主要由骨髓中分離獲得，也可從骨實質(zhì)、脂肪組織、臍帶、臍血、胎肺、羊水、骨骼肌等組織中分離[1]。除了造血支持外，MSCs還具有免疫調(diào)節(jié)作用，是良好的細(xì)胞和基因治療載體，在自體和異體造血細(xì)胞移植過程中有著顯著的臨床價值[3-5]。MSCs分泌廣譜的生物活性分子，促進(jìn)局部血管新生，抑制纖維化和瘢痕形成，改善局部微環(huán)境，是重要的組織工程種子細(xì)胞[6]。美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)多項涉及MSCs的臨床試驗[1]，包括:①MSCs輸注治療異基因骨髓移植中的移植物抗宿主反應(yīng)；②MSCs靜脈輸注治療Crohn??；③MSCs局部應(yīng)用治療牙周疾病；④MSCs靜脈輸注治療心肌梗死；⑤MSCs修復(fù)半月板損傷。由于對細(xì)胞數(shù)量的要求，所有的臨床試驗均面臨MSCs的體外擴(kuò)增問題。然而，迄今為止，國際上并未建立一套公認(rèn)的規(guī)范擴(kuò)增方案和臨床流程。由于異種蛋白內(nèi)在化、動物病毒感染和異種免疫反應(yīng)等多種風(fēng)險，早先建立的以胎牛血清為標(biāo)準(zhǔn)支持物的培養(yǎng)方案越來越受到人們的質(zhì)疑。因此，避免使用異種血清的新型培養(yǎng)體系研究迫在眉睫。

關(guān)于MSCs的定義，學(xué)術(shù)界形成了包括物理學(xué)、形態(tài)學(xué)、表型和功能屬性的四項基本共識[1]。2006年，國際細(xì)胞治療學(xué)會間質(zhì)組織干細(xì)胞委員會提出了3條最低標(biāo)準(zhǔn)：塑料貼附性、特定的細(xì)胞表面抗原表達(dá)和多向分化潛能[7]。本研究中我們使用PL作為非異種血清的新型培養(yǎng)體系，所獲得的細(xì)胞為典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，呈漩渦狀、塑料貼壁生長，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD73、CD166和CD29，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD34、CD45和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31。在一定的誘導(dǎo)條件下，MSCs可定向分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，具有多向分化潛能。比照定義標(biāo)準(zhǔn)，我們研究的PL體系與標(biāo)準(zhǔn)FCS體系一樣可獲得具有典型生物學(xué)特性的MSCs，質(zhì)量可靠。

應(yīng)用于臨床治療，MSCs需要在較短時間內(nèi)擴(kuò)增至足量的細(xì)胞數(shù)目。因此，對于MSCs培養(yǎng)支持物，除了要獲得符合標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞，還需要良好的擴(kuò)增效率。在某種程度上，這是關(guān)鍵問題。我們將其作為基本問題考察了PL新培養(yǎng)體系的擴(kuò)增效率。有人研究用自體血清來擴(kuò)增MSCs，卻發(fā)現(xiàn)過了第1代后，即產(chǎn)生生長停滯[8]。在臨床應(yīng)用中，體外擴(kuò)增一般不超過第3代即回輸體內(nèi)。我們選用第5代細(xì)胞可反應(yīng)具體應(yīng)用的各種實際情況，因此我們的結(jié)果具有現(xiàn)實價值。MTT增殖試驗表明，PL體系對MSCs的擴(kuò)增效率優(yōu)于傳統(tǒng)FCS體系。相對于FCS體系，PL體系發(fā)揮促MSCs增殖的作用，可能主要依賴于其間存在的細(xì)胞因子，例如PDGF、TGF-β、IGF、EGF、FGF、VEGF等[9]。為了排除不同個體來源間的差異，我們將5人份PRP混勻制備PL以減少差異。目前我國臨床用血普遍緊張，因此我們需要尋求一個較低的最適濃度。我們的結(jié)果已表明，1.25%的PL濃度即可獲得與10%FCS相當(dāng)?shù)臄U(kuò)增效率，這大大降低了使用量，也為日后開展有關(guān)研究提供了理論依據(jù)。

PL擴(kuò)增效應(yīng)的內(nèi)在分子機(jī)制，及其對MSCs的分子學(xué)改變都有待更多的研究來揭示。此外，血小板相關(guān)膜抗原引發(fā)的體內(nèi)免疫學(xué)反應(yīng)也應(yīng)引起重視。

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Platelet Lysates Enhance the Proliferation of Human Bone-Marrow Stromal Cells In Vitro

LOU Xiao,WANG Jinsong,JIN Jide,HE Ziming,WU Zuze,GUO Zikuan.
Institute of Radiation and Irradiation Medicine,Academy of Military Medical Science,Beijing 100850,China.Corresponding author:GUO Zikuan.

ObjectiveTo investigate the suitability and proliferation capacity of human platelet lysate in the production of bone-marrow stromal cells.MethodsHuman platelet lysates(PL)were prepared by freezing and thawing the platelet rich plasma.Marrow stromal cells(MSCs)were cultured in media containing PL and their proliferation status was evaluated by MTT assay.Furthermore,cell phenotypic characteristics were analyzed by flow cytometry and the differentiation along adipogenic and osteogenic pathways were assessed by histological staining in vitro.ResultsMSCs cultured in medium containing platelet lysates displayed a typical fibroblast-like morphology.Flow cytometry showed that they were homogenously negative for CD14,CD31,CD34,CD45 and HLA-DR and positive for CD73,CD90,CD105 and CD166.Differentiation capacity was preserved throughout the long-term culture.Compared with fecal calf sera(FCS)selected from lots,platelet lysates exhibited more potent activities to support the expansion of MSCs.ConclusionIt is concluded that human platelet lysates might be an optional substitute to FCS for MSCs proliferation in vitro.

Bone marrow stromal cells;Platelet;Cell culture;Proliferation

Q813.1+1

A

1673－0364（2009）－02－0061－04

2009年2月27日；

2009年3月30日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.04.001

國家高技術(shù)發(fā)展計劃項目（863）（2007AA02Z454），國家自然科學(xué)基金（30871018）。

100850北京市軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所實驗血液學(xué)研究室。

郭子寬。