食管鱗癌p53、TSP-1、VEGF表達與腫瘤血管生成

丁旭青， 韓玉培

腫瘤生長和轉(zhuǎn)移有賴于血管生成。血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)是有效的血管生成抑制因子[1]，而血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管生成促進因子[2]，p53通過調(diào)節(jié)TSP-1和VEGF的表達來影響腫瘤血管的生成[3]。我們采用免疫組化SP法檢測了68例食管鱗癌組織中p53、TSP-1及VEGF的表達及腫瘤微血管密度(microvessel density，MVD)，以探討其在食管鱗癌血管生成中的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取南陽市第二人民醫(yī)院胸外科2007年9月至2009年3月食管癌手術(shù)切除標(biāo)本68例，術(shù)前患者未經(jīng)任何抗腫瘤治療，術(shù)后常規(guī)病理切片證實為鱗癌。其中男性52例，女性16例，年齡34～76歲，中位年齡55歲。組織學(xué)分級：高中分化鱗癌35例，低分化33例。TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期29例，Ⅲ～Ⅳ期39例。

1.2 試劑 鼠抗人TSP-1單克隆抗體、鼠抗人p53單克隆抗體(突變型)、鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人CD31單克隆抗體，均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 p53(突變型)檢測 p53陽性表現(xiàn)為細(xì)胞核中出現(xiàn)清晰棕黃色顆粒，單純胞漿著色尚無胞核著色或均無著色為陰性細(xì)胞。按陽性細(xì)胞占癌細(xì)胞的比例分為4個等級：未見陽性細(xì)胞為(-)，陽性細(xì)胞<25%為(+)，25%～50%為(++)，>50%為(+++)。為方便統(tǒng)計分析，將(-)；(+)定為陰性組，將(++)、(+++)定為陽性組。

1.4 TSP-1檢測 TSP-1定位胞漿，呈棕黃色顆粒。無陽性細(xì)胞為陰性；陽性細(xì)胞數(shù)< 10%為弱陽性，10%～50%為陽性，>50%為強陽性。將陰性和弱陽性定為陰性組，將陽性和強陽性定為陽性組。

1.5 VEGF檢測 VEGF判定標(biāo)準(zhǔn)：VEGF胞漿著色，呈棕黃色顆粒狀。陽性細(xì)胞數(shù)≥30%者判為陽性。

1.6 MVD檢測 按照Weidner[4]的評判標(biāo)準(zhǔn)，凡呈現(xiàn)棕色單個細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞群者均作為1個血管計數(shù)，但肌層較厚及管腔面積>8個紅細(xì)胞直徑的血管不計數(shù)。每張切片選擇3個血管較多的癌間質(zhì)區(qū)，在200倍視野下進行血管計數(shù)，每例標(biāo)本分別計數(shù)5個視野，取其平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行t檢驗、χ2檢驗和Spearman相關(guān)分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.01。

2 結(jié)果

2.1 p53、TSP-1、VEGF和MVD的表達 p53陽性染色主要位于癌細(xì)胞核內(nèi)，總陽性率為72.06%；TSP-1 和VEGF棕黃色染色主要位于腫瘤細(xì)胞胞漿，間質(zhì)亦有輕微著色，總陽性率分別為29.41%和64.71%；腫瘤組織內(nèi)微血管經(jīng)CD31染色后，呈棕色或棕黃色，管腔清晰，也可見條索狀血管，其MVD平均值為24.085±5.605。

2.2 p53與TSP-1的關(guān)系 p53陽性表達49例中，TSP-1陽性8例，陰性41例；p53陰性表達19例中，TSP-1陽性12例，陰性7例。Spearman相關(guān)分析表明，p53與TSP-1顯著負(fù)相關(guān)(χ2=20.000，rs=-1.000，P<0.01)。

2.3 p53與VEGF的關(guān)系 p53陽性表達49例中，VEGF陽性41例，陰性8例；p53陰性表達19例中，VEGF陽性3例，陰性16例。Spearman相關(guān)分析表明，p53與VEGF顯著正相關(guān)(χ2=44.000，rs=1.000，P<0.01)。

2.4 TSP-1與MVD的關(guān)系 TSP-1陽性組MVD均值為18.37±4.86，陰性組為29.80±6.35，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.735，P<0.01)。Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，TSP-1陽性表達與MVD呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.783，P<0.01)。

3 討論

p53基因有野生型和突變型之分。正常細(xì)胞中野生型p53基因參與細(xì)胞周期的調(diào)控，可以阻止細(xì)胞于G1/S期，一旦突變則可導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖，產(chǎn)生癌變。近年研究發(fā)現(xiàn)，p53基因突變與多種腫瘤如胃癌、賁門癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等的血管生成和不良預(yù)后相關(guān)[5]。因野生型p53半衰期短，不易檢測，研究中多采用突變型p53。本研究結(jié)果支持上述結(jié)論，p53陽性患者其血管生成豐富，提示p53陽性細(xì)胞具有較強的轉(zhuǎn)移特性。

研究表明腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移依賴于血管形成。TSP-1是一種多功能細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，屬于TSP家族成員之一[1]。TSP-1是腫瘤血管形成抑制因子，近年來發(fā)現(xiàn)TSP-1可由多種腫瘤細(xì)胞合成分泌，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的粘附遷移以及新生血管形成中發(fā)揮重要作用。Tolsma等[6]發(fā)現(xiàn)抗TSP-1抗體可消除TSP-1對血管新生各階段的抑制作用。Moon等[7]的研究表明某些癌癥患者發(fā)生“腫瘤休眠”的分子基礎(chǔ)是TSP-1，TSP-1能夠使腫瘤轉(zhuǎn)移降低15～20倍，提示TSP-1具有強大的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用。我們發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中TSP-1表達下調(diào)，且其表達與MVD呈負(fù)相關(guān)，提示TSP-1與食管鱗癌的血管形成有關(guān)，其表達水平升高可抑制血管生成。

近來發(fā)現(xiàn)野生型p53可以上調(diào)TSP-1的表達而抑制血管新生，而突變型p53則下調(diào)TSP-1表達促進血管新生[3]。Iddings等[8]證明靜脈導(dǎo)入攜有p53 基因的陽離子脂質(zhì)體DNA復(fù)合物可有效抑制荷瘤鼠腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，并發(fā)現(xiàn)通過刺激TSP-1合成而抑制瘤體內(nèi)血管新生是p53抑癌效應(yīng)的一個重要機制。本研究顯示p53的表達與TSP-1表達密切相關(guān)，突變型p53表達增高時，TSP-1表達下降，反之TSP-1表達上升，表明突變型p53對TSP-1基因具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。

近年來研究還發(fā)現(xiàn)，野生型p53可抑制酪氨酸蛋白激酶介導(dǎo)的VEGF的上調(diào)，而突變型p53則可通過激活蛋白激酶C(protein kinase, PKC)上調(diào)VEGF。Linderholm等[9]發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中p53陽性表達組VEGF值明顯高于p53陰性組。本實驗在食管鱗癌中也發(fā)現(xiàn)p53陽性組的VEGF表達高于陰性組，經(jīng)Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，突變型p53與VEGF呈正相關(guān)。由此可見，突變型p53可導(dǎo)致VEGF過表達，刺激血管、淋巴管新生，促進腫瘤轉(zhuǎn)移。

綜上所述，p53通過調(diào)節(jié)TSP-1和VEGF的表達而影響腫瘤組織血管生成。突變型p53不但抑制TSP-1的表達，同時又刺激了VEGF的轉(zhuǎn)錄，進而促進了食管鱗癌組織的血管生成。3種因子的檢測對研究食管鱗癌的侵襲與轉(zhuǎn)移有著重要的意義。

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