【文獻標識碼】B
【文章編號】1673-0364(2009)-06-0352-04
doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.017
作者單位:200233上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院整形外科。
瘢痕組織是人體創(chuàng)傷修復(fù)過程中的自然產(chǎn)物。在正常的創(chuàng)傷愈合過程中,成纖維細胞合成和分泌以Ⅰ型膠原纖維為主的細胞外基質(zhì),膠原的合成代謝與降解代謝之間維持著平衡狀態(tài),無論是膠原合成的增加或者降解的減少都會導(dǎo)致膠原的大量堆積,最終導(dǎo)致增生性瘢痕或者瘢痕疙瘩的形成 [1,35]。主要合成和分泌膠原纖維的(肌)成纖維細胞 [2-3],在細胞增殖和凋亡之間也維持著平衡狀態(tài) [4-5]。在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中這種平衡被破壞,(?。┏衫w維細胞的增殖超過了凋亡,膠原的合成明顯超過降解,最終導(dǎo)致大量的膠原堆積。導(dǎo)致這種變化的確切病因尚不清楚,但是在燒傷患者中,增生性瘢痕往往發(fā)生于延遲愈合的患者身上。采取了網(wǎng)狀皮片移植的患者,常在沒有表皮覆蓋的肉芽組織間發(fā)生增生性瘢痕,在缺乏上皮覆蓋的傷口,真皮內(nèi)的成纖維細胞會分泌更多的細胞外基質(zhì)。臨床觀察的結(jié)果提示,正常的表皮結(jié)構(gòu)對于瘢痕形成有抑制作用。在皮膚損傷的修復(fù)過程中,表皮干細胞對于上皮的修復(fù)起著重要的作用,意味著表皮干細胞對于瘢痕的預(yù)防和治療具有積極的意義。
表皮干細胞主要定位于毛囊外根鞘隆突部及皮膚基底細胞層 [10],毛囊外根鞘隆突部是皮膚干細胞的主要棲存地。表皮干細胞不但對毛囊生長、修復(fù)和新陳代謝起關(guān)鍵作用,且對表皮損傷后的修復(fù)同樣具有重要意義。表皮干細胞具有多向分化潛能,可分化為毛干、內(nèi)髓鞘、外髓鞘、和皮膚表皮角質(zhì)細胞以及皮脂腺等 [1],創(chuàng)傷修復(fù)后的表皮細胞也來自于基底層干細胞或者周圍附屬器內(nèi)的表皮干細胞的激活和增殖。目前,表皮干細胞的表面特異性標記物尚無定論,但較多采用一些細胞表面糖蛋白,如整合素家族的Integrinβ1和Integ鄄rinα6、角蛋白K19、基因物質(zhì)P63等作為主要鑒定手段 [10]。近來發(fā)現(xiàn)表皮干細胞不僅是形成正常表皮增殖單位必不可少的來源,而且相關(guān)實驗證實了表皮干細胞在創(chuàng)傷應(yīng)激刺激后快速形成短暫增殖細胞,然后進一步形成角質(zhì)細胞被快速募集至創(chuàng)面中心完成上皮化過程及創(chuàng)面修復(fù)。正常的上皮化過程對于傷口愈合十分重要,如果上皮化的持續(xù)時間超過3周,就會發(fā)生增生性瘢痕或者瘢痕疙瘩 [36]。
本文對表皮干細胞如何通過各種信號通路的調(diào)節(jié)影響修復(fù)的進程和結(jié)果,以及表皮干細胞如何通過上皮化作用影響傷口愈合而形成瘢痕等問題進行綜述。
1 表皮干細胞參與創(chuàng)傷愈合的信號通路
1.1 Wnt信號通路
Wnt信號通路是動物的胚胎發(fā)育和組織器官形成時期的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,主要通過細胞與細胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細胞增值、分化、凋亡及抗凋亡過程。Wnt信號通路主要指經(jīng)典Wnt信號通路,即Wnt/β-catenine信號通路和10個非經(jīng)典的Wnt信號通路:Wnt/PCP(Planar cell polarity)信號通路,Wnt-cGMP、Ca 2+信號通路,Wnt-RAP1信號通路,Wnt-ROR2信號通路,Wnt-PKA信號通路,Wnt-GSK3-MT(Microtubule)信號通路,Wnt-aPKC信號通路,Wnt-RYK信號通路,WntmTOR信號通路等 [46-47]。Wnt在細胞膜上有兩種受體:Frizzled受體和脂蛋白受體。細胞外的Wnt蛋白與細胞膜上的受體結(jié)合之后,受體在磷酸化后通過下調(diào)GSK3β將信號傳遞到細胞內(nèi),解除APC蛋白、糖原合成激酶(GSK-3β)、軸素(Axin)、蛋白酶復(fù)合體體對β-連環(huán)蛋白的抑制,活化之后的β-連環(huán)蛋白進入細胞核,與Lef/Tcf家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,從而激活轉(zhuǎn)錄因子,進一步激活靶基因開始轉(zhuǎn)錄。通常情況下,成體哺乳動物的Wnt基因在機體中處于靜息狀態(tài);皮膚損傷時,激活了深層皮膚,Wnt基因表達Wnt蛋白,Wnt蛋白激活隆突部的表皮干細胞使其增殖、分化以實現(xiàn)皮膚損傷的修復(fù) [48]。
Fathke等 [49]在傷口局部使用氯化鋰抑制糖原合酶激酶3GSK-3β使β-catinen積聚,從而增強Wnt信號通路表達,發(fā)現(xiàn)毛囊間表皮細胞再生模式被改變,表皮創(chuàng)傷愈合面形成包含有毛囊結(jié)構(gòu)和皮脂腺結(jié)構(gòu)表皮囊腫。這說明表皮細胞在受到增強的Wnt信號誘導(dǎo)后可以轉(zhuǎn)化為類似毛囊的形態(tài),是Wnt信號決定了皮膚細胞分化的方向。在細胞核內(nèi),Lef/Tcf家族不同的因子在通路中發(fā)揮不同作用,在正常毛囊干細胞中,Tcf3的表達被抑制而正常表達Lef1,Lef1與β-catinen協(xié)同作用促使短暫增殖細胞進一步分化形成內(nèi)毛根鞘。當(dāng)毛囊干細胞內(nèi)β-catinen在胞質(zhì)表達穩(wěn)定時,Tcf3的抑制被解除,毛囊干細胞被激活,分化并參與毛囊和表皮的增殖再生 [50]。
1.2 FGF信號通路
FGF家族成員擁有由大約120個同源氨基酸殘基序列組成的核心區(qū)域,F(xiàn)GF受體為絡(luò)氨酸激酶受體,分為FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4等亞型,各亞型都具有細胞外的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)的絡(luò)氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。FGF與硫酸乙酰肝素粘多糖緊密結(jié)合后,與細胞膜上的絡(luò)氨酸激酶受體結(jié)合,受體形成二聚體,細胞內(nèi)的絡(luò)氨酸激酶活化,受體自身啟動磷酸化過程 [51]?;罨氖荏w通過FRS2-GRB2-GAB1-PI3KAKT信號級聯(lián)放大通路,最終下調(diào)GSK3β的表達,解除βcatenin的抑制,活化后的β-連環(huán)蛋白進入細胞核,與Lef/Tcf家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,從而激活轉(zhuǎn)錄因子,進一步激活靶基因轉(zhuǎn)錄。FGF信號通路通過該途徑與Wnt信號途徑相互作用,調(diào)節(jié)毛囊中表皮干細胞的分化方向,在創(chuàng)傷修復(fù)中起重要作用。
FGF最初是作為成纖維細胞或上皮細胞生成促進因子被發(fā)現(xiàn)的,現(xiàn)已明確它們在脊椎動物胚胎形成過程具有調(diào)節(jié)干細胞發(fā)育方向的功能。Stern等 [52]使用外源性方法阻斷小鼠胚胎發(fā)育中的外胚層對成纖維生長因子(FGFs)的反應(yīng),沒有FGFs表達的細胞中骨形成蛋白(MBPs)的表達增強,促使神經(jīng)外胚層向神經(jīng)分化受抑制,而分化成胚胎表皮。Kawano等 [53-54]對小鼠全層皮膚中的mRNA進行定量分析以了解FGF家族的22個成員及其受體的表達情況,發(fā)現(xiàn)FGF1、FGF2、FGF5、FGF7、FGF10、FGF13、FGF18、FGF22在皮膚中表達于毛囊增殖周期的不同階段,不同的FGF有著不同的表達高峰,其中FGF18能促進體外培養(yǎng)的人成纖維細胞、毛囊隆突細胞、表皮角質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞的DNA合成,對毛囊形成及毛囊干細胞參與創(chuàng)面修復(fù)過程有重要促進作用。應(yīng)用RT-PCR和原位雜交檢測發(fā)現(xiàn),F(xiàn)GF13 mRNA在毛囊再生和創(chuàng)傷修復(fù)中表達水平增高,免疫組化檢測提示FGF13蛋白僅在毛囊隆突區(qū)域表達。FGF13可能在調(diào)節(jié)毛囊bulge細胞以及表皮基底層細胞的功能上發(fā)揮作用
1.3 BMP/TGF-β信號通路
骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是TGF-β超家族成員中最大的一族,通過調(diào)節(jié)一群廣泛多樣的基因活性,控制著機體組織器官的基本發(fā)育過程。BMPs與BMPⅡ型受體結(jié)合,Ⅱ型受體其胞質(zhì)段的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域活性升高,能持續(xù)作用使Ⅱ型受體磷酸化Ⅰ型受體,磷酸化后的Ⅰ型受體又能使轉(zhuǎn)錄因子Smad磷酸化,并與Smad結(jié)合構(gòu)成復(fù)合物進入核內(nèi),啟動下游靶基因的表達 [55]。Smads蛋白是TGF-β1家族傳遞受體信號到細胞核內(nèi)的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,是目前所知唯一的激酶受體激活后在細胞內(nèi)的底物。受體激活型Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8,可被Ⅰ型受體特異的絲氨酸激酶磷酸化而活化,然后才能與Co-Smad(即Smad4)結(jié)合并形成復(fù)合物,轉(zhuǎn)移到核內(nèi)調(diào)控轉(zhuǎn)錄。Smad6和Smad7屬于抑制性Smads,可與活化的Ⅰ型受體競爭性結(jié)合,阻止其他類型Smads的磷酸化,從而抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo) [56]。
在毛囊增殖周期中,處于真皮中的BMP2、BMP4也隨之發(fā)生周期性改變,在毛囊的退行期BMP2、BMP4呈高表達,在毛囊周期的恒定增殖期卻處于低表達水平,這正好與Wnt/β-catinen在毛囊周期中相同時期的表達相反。BMP在毛囊干細胞周圍的穩(wěn)定表達可維持毛囊干細胞的靜息狀態(tài),阻止了毛囊干細胞的激活,卻可以促進毛囊角質(zhì)細胞的進一步分化而促使毛囊分化成熟 [57]。Smad4主要通過激活細胞凋亡通路來維持TGF信號誘導(dǎo)毛囊進入退行期,BMP和Wnt/β-catinen兩條信號通路相互制衡以調(diào)節(jié)毛囊干細胞毛囊周期和表皮再生。
1.4 Notch信號通路
Notch基因編碼一種膜蛋白受體,它的兩種膜蛋白配體Delta和Serrate表達在相鄰細胞的細胞膜上。當(dāng)配體和Notch的胞膜外區(qū)結(jié)合時,Notch的胞內(nèi)區(qū)(Intracellular domain of Notch,ICN)被金屬蛋白酶(MMP)或γ分泌酶切割,脫離細胞膜成為具有活性的游離狀態(tài)。活化的ICN被轉(zhuǎn)運入細胞核并與Su(H)(Suppressor of Hairless)即RBP-Jκ結(jié)合,Su(H)單獨存在時是一種抑制性的轉(zhuǎn)錄因子,ICN的結(jié)合使Su(H)轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活子,激活Notch誘導(dǎo)基因(Notch2 inducible genes)的轉(zhuǎn)錄。ICN-Su(H)復(fù)合物直接誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的靶基因是E(spl)(Enhancer of Split),E(spl)是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix2loop2helix,bHLH)類轉(zhuǎn)錄因子,它又調(diào)節(jié)其他與細胞分化直接相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄 [64]。Notch信號通路通過參與Wnt信號的下游通路決定著表皮干細胞的分化方向。
其他調(diào)節(jié)表皮干細胞參與創(chuàng)傷修復(fù)的信號通路還有MAPK通路、鈣粘蛋白-NFATc1-CDK4通路等,它們之間具有復(fù)雜的交聯(lián)關(guān)系,在毛囊干細胞參與創(chuàng)傷修復(fù)的過程中相互聯(lián)系構(gòu)成一個網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。毛囊干細胞通過一系列復(fù)雜的調(diào)節(jié)最終完成傷口的上皮化。研究結(jié)果表明,阻斷通路的某些步驟或者改變某些關(guān)鍵信號分子的含量,可以實現(xiàn)對于表皮干細胞分化的調(diào)控,而有望實現(xiàn)創(chuàng)傷無瘢痕愈合。
2 上皮化過程對于成纖維細胞的影響
創(chuàng)傷的愈合過程分為3個階段:炎癥反應(yīng)階段、增殖階段以及塑形階段 [6-7]。在傷口的上皮化過程中,根據(jù)傷口深度的不同,上皮化的方式有所不同。如果皮膚的基底層是完整的,缺損的表皮由皮膚基底細胞層內(nèi)的表皮干細胞以自下向上分化增殖的方式進行修復(fù)。如果皮膚的基底層受到破壞,傷口則由傷口邊緣附屬器內(nèi)的表皮干細胞向傷口方向分化、增殖、遷移而進行修復(fù) [8-10]。
正常的上皮化過程對于傷口的正常愈合十分重要,如果上皮化的持續(xù)時間超過3周,就會發(fā)生增生性瘢痕或者瘢痕疙瘩 [36],表皮細胞在表皮化的過程中受到來自表皮細胞自身以及真皮層的多重調(diào)節(jié)。表皮細胞遷移、增值、分化的過程通過可溶性的細胞因子以旁分泌、自身分泌的形式相互作用 [14]。傷口形成之后,表皮細胞分泌儲存的IL-1α,IL-1α活化成纖維細胞和鄰近的表皮細胞,趨化內(nèi)皮細胞和淋巴細胞到創(chuàng)傷區(qū)域 [15]。成纖維細胞依次分泌FGF7、GM-CSF,進一步活化基底層附近的表皮細胞,活化過程同時受到來自創(chuàng)面的巨細胞、表皮細胞、單核細胞、巨噬細胞所分泌的TNF-α EGF家族(TGF-a、EGF、HG-EGF)、CXCL8和IFN-g的調(diào)控 [15-16]。在傷口正常上皮化過程結(jié)束后活化停止,但是在增生性瘢痕中表皮細胞在上皮化結(jié)束后仍然處于活化狀態(tài) [17-19]。受傷后24 h,表皮細胞在巨噬細胞、成纖維細胞、表皮細胞分泌的TGF-b1、HB-EGF、EGF、TGF-a、HGF、NGF、FGF7、VEGF、CXCL1、IL-6 和GM-CSF作用下開始增殖 [20-22]。沒有來自于成纖維細胞的信號,表皮細胞無法形成具有功能的上皮 [23]。增殖階段結(jié)束后,表皮細胞在FGF7和GM-CSF刺激下開始分化 [24]。與愈合早期不同,在愈合終末期,成纖維細胞分泌的TGF-β誘導(dǎo)表皮細胞由活化狀態(tài)轉(zhuǎn)化為失活狀態(tài) [15],失活的表皮細胞又誘導(dǎo)成纖維細胞減少膠原的生成 [25-26]。和正常瘢痕組織內(nèi)的表皮細胞相比,增生性瘢痕內(nèi)表皮細胞的增殖和分化能力都有不同程度的提高 [18,27]?;钚栽鰪姷谋砥ぜ毎麥p少了IL-1的分泌并提高PDGF的表達,從而直接促進了成纖維細胞膠原的合成與分泌 [28]。在體外聯(lián)合細胞培養(yǎng)中,瘢痕疙瘩來源的活化的成纖維細胞可以誘導(dǎo)正常皮膚的成纖維細胞大量合成CTFG、TGF-β、VEGF [39-31],并且促進膠原合成與分泌 [32-33]。
3 干細胞應(yīng)用于瘢痕治療的研究進展
表皮干細胞的增殖分化行為,一方面被細胞本身所預(yù)先程序化,另一方面又受其所處的微環(huán)境(干細胞壁龕)的影響,即干細胞壁龕通過細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)兩種方式調(diào)控干細胞的增殖分化,細胞因子在傳遞細胞與細胞外基質(zhì)之間、細胞與細胞之間的信息中起重要作用,細胞外基質(zhì)成分,如纖維結(jié)合蛋白、層黏連蛋白以及不同類型的膠原等均參與了表皮干細胞特征的維持及其增殖、分化等生物學(xué)行為的調(diào)控 [40]。
表皮干細胞在瘢痕治療方面的研究及應(yīng)用進展主要集中在兩個方面。
①應(yīng)用EGF促進傷口原位的表皮干細胞生長,加速上皮化的過程。
表皮干細胞在傷口上皮化過程中起著重要作用。許多調(diào)節(jié)因子,例如細胞因子、生長因子誘導(dǎo)并且調(diào)節(jié)傷口原位表皮干細胞的聚集、增殖和分化,以此促進傷口上皮化和傷口愈合。Ghalbzouri等 [41]用手術(shù)刀在皮膚(HSE)上制造全層損傷,部分創(chuàng)面給予外源性生長因子,觀察傷口上皮化的速度。實驗結(jié)果表明:表皮生長因子(EGF)的表達可以促進角質(zhì)化細胞的遷移和增殖,進而加速傷口的上皮化過程。單細胞層傷口的愈合速度取決于細胞數(shù)量的增加。另有實驗表明:外源性的表皮生長因子(EGF)可以提高單個細胞的運動能力,促進單層傷口的愈合速度 [42]。
黃暉等 [38]發(fā)現(xiàn),感覺神經(jīng)肽P物質(zhì)能明顯加速創(chuàng)面愈合速度,并具有誘導(dǎo)表皮干細胞向創(chuàng)緣集中和向創(chuàng)面肉芽組織中遷移的作用。付小兵等 [39]報道,表皮細胞生長因子可通過誘導(dǎo)皮膚干細胞增殖、分化而加速受創(chuàng)表皮再生;而經(jīng)重組人表皮細胞生長因子治療的慢性皮膚潰瘍,在修復(fù)創(chuàng)面過程中,可見表皮棘細胞層有少量表皮干細胞島,初步認為可能是由成熟的表皮細胞逆分化而來,其中EGF是一個重要的誘導(dǎo)因素。這一結(jié)果不僅使人們對EGF促進創(chuàng)面愈合的機制產(chǎn)生了新認識,而且可能為將來利用表皮干細胞進行皮膚功能性修復(fù)提供了新思路。
除了外源性生長因子對于上皮化的促進作用,相關(guān)研究表明傷口附近的角質(zhì)化細胞分泌的內(nèi)源性生長因子和細胞因子可以加速傷口上皮化的過程。Myers等 [21]的研究認為,提高傷口處生長因子和細胞因子的表達水平,可以活化毛囊和表皮內(nèi)的表皮干細胞,加快上皮化,最終促進傷口的愈合。
②利用表皮干細胞通過組織工程技術(shù)構(gòu)建組織工程皮膚,覆蓋傷口以加速上皮化。
大面積燒傷患者,往往采用創(chuàng)面斷層皮片移植的方法覆蓋創(chuàng)面,以促進傷口愈合并減少瘢痕形成。但是自體取皮會造成供皮區(qū)損傷,而且還存在著供區(qū)不足的問題 [43]。利用患者自身的表皮細胞進行培養(yǎng),形成連續(xù)的大張表皮之后,將其從培養(yǎng)皿上小心取下,直接覆蓋于燒傷或者潰瘍傷口表面 [44],這種方法培養(yǎng)時間過長,而且培養(yǎng)獲得的表皮比較脆,表皮與傷口的粘附效果亦欠佳。利用組織工程技術(shù),在體外將大量培養(yǎng)的表皮干細胞種植在富含成纖維細胞的膠原海綿表面,構(gòu)建組織工程皮膚,并移植到裸鼠皮膚的全層傷口處覆蓋傷口,結(jié)果顯示,經(jīng)此處理的傷口比未經(jīng)處理的傷口愈合快,瘢痕也較輕微 [46]。
4 展望
隨著表皮干細胞研究的深入,應(yīng)用表皮干細胞治療增生性瘢痕以及瘢痕疙瘩有著廣闊前景,但是調(diào)節(jié)表皮干細胞分化的通路十分復(fù)雜,利用調(diào)節(jié)通路的方法實現(xiàn)創(chuàng)傷無瘢痕愈合等問題仍需更深入的研究。臨床應(yīng)用前必須解決在體外快速、足量獲得干細胞的問題,將來能夠通過分離、純化表皮干細胞,精度調(diào)控其增殖分化以及關(guān)鍵信號通路等手段實現(xiàn)創(chuàng)面的無瘢痕愈合。