人工合成支架材料在組織工程脂肪源干細胞研究中的應用

【文獻標識碼】B

【文章編號】1673－0364（2009）－06－0346－03

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.015

作者單位：200011上海市　上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院普外科。

組織工程技術有望改變傳統(tǒng)的“以創(chuàng)傷修復創(chuàng)傷”的治療模式，能改變組織缺損治療中的供體來源不足等缺陷，已成為世界范圍內(nèi)的修復重建外科領域內(nèi)的研究熱點。

種子細胞、支架材料和促進種子細胞在支架上增殖分化的多種因子是組織工程研究的三大基本要素。其中，支架材料在組織構建中起著至關重要的作用。它能夠模擬天然細胞外基質(zhì)環(huán)境，在種子細胞形成組織前，引導種子細胞分化、組織再生和控制組織結構，同時還有利于種子細胞獲取細胞生長、分化和細胞間相互作用所需的所有細胞因子；而一旦新生組織形成后，通過自身生物降解促進新生組織融入周圍的宿主組織中。此外，在體外培養(yǎng)時，它有助于種子細胞從培養(yǎng)基中獲得營養(yǎng)，而在移植后又能有效地血管化，通過向支架內(nèi)生長的血管為種子細胞進一步供應營養(yǎng)。

理想的組織工程支架材料應具備：①良好的生物相容性，不引起宿主的排異反應；②高孔隙度和高表面積的三維立體結構，便于細胞的粘附以及營養(yǎng)和代謝物質(zhì)的交換；③良好的表面活性，有利于細胞的粘附、鋪展、增殖；④生物可降解性，且降解和吸收的速度應該與組織形成的速度相匹配，降解產(chǎn)物不對細胞生長和增殖產(chǎn)生不利的影響。此外，若支架本身能夠緩釋生長因子等生物大分子則更有利于細胞的生長、增殖、分化以及組織的再生。

1　脂肪源干細胞（Adipose-derived stem cell，ASCs）

近年來，對種子細胞的選擇越來越傾向于體外擴增能力強、供區(qū)損失小的基質(zhì)干細胞。2001年，ZuK等 [1]證實，通過吸脂術獲得的脂肪組織中存在具有多向分化潛能的細胞群。ASCs具有多向分化潛能，且體外擴增能力強、來源充足、獲取方便，與骨髓間充質(zhì)干細胞類似 [2]，目前已廣泛應用于脂肪、骨、軟骨等多種組織的缺損修復和組織再生的研究。

2　脂肪源干細胞組織工程支架的分類

目前,脂肪源干細胞組織工程支架材料的研究主要涉及天然材料和人工合成材料兩大類。天然材料支架（如膠原、殼聚糖等）具有良好的生物相容性、毒性較小、易降解且降解產(chǎn)物易吸收而不產(chǎn)生炎癥反應等優(yōu)點，但也存在機械強度不足、降解速度快以及無法大規(guī)模生產(chǎn)等缺點。而人工合成材料的具有良好的物理、力學特性，能通過分子量及分子量分布的改變以調(diào)節(jié)降解速度，其結構和性能可人為進行修飾和調(diào)控，來源充足，加工性能好。人工合成支架材料主要包括高分子材料、生物陶瓷材料和納米材料等。

2.1　高分子材料

依據(jù)大分子主鏈結構特征的不同，高分子材料可分為聚酯類、聚酸酐類、聚酰胺類、聚原酸酯類、聚氰基丙烯酸酯類等。目前，脂肪源干細胞組織工程研究中應用較多的主要有聚乳酸（Polyactic acid，PLA）、聚乙醇酸（Polyglycolic Acid，PGA）以及二者的共聚物PLGA（Poly-lactide-co-glycolide）等。

PLA和PGA是結構最簡單、最典型的可降解線性聚羥基脂肪酸酯，具有極高的生物相容性和生物安全性，其降解產(chǎn)物分別為乳酸和羥基乙酸，均是參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，目前已獲得美國FDA批準而應用于臨床。但是，PGA機械性能較差，受力易變形，會導致種子細胞的損傷，且降解速度快；而PLA疏水性大，與細胞的親和力較差，且易導致無菌性炎癥，其降解產(chǎn)物乳酸所造成的酸性環(huán)境在一定程度上影響細胞的成活 [3]。二者的共聚物PLGA兼具了各自的優(yōu)點，并可以通過調(diào)節(jié)其分子量、混合比例、結晶性等來獲得更穩(wěn)定、更均勻的降解速度，從而更好地維持了結構的完整性 [4]。

Mehlhorn等 [5]利用PLGA支架（PLA∶PGA=90∶10）來觀察脂肪源干細胞向軟骨細胞的分化，結果發(fā)現(xiàn)，8周后PLGA仍能保持其支架結構，這除了與PLGA本身適宜的降解速度有關以外，還可能與ASCs產(chǎn)生細胞外基質(zhì)的屏蔽作用和產(chǎn)生可溶性免疫調(diào)節(jié)因子，如白細胞介素-10和腫瘤壞死因子-a等，抑制體內(nèi)免疫反應，減緩PLGA支架纖維的降解有關。此外，據(jù)檢測，在體外孵育90 min后支架中細胞貼壁的比例可達到83%，從而顯示PLGA支架和脂肪源干細胞具有良好的相容性。研究還發(fā)現(xiàn)，PLGA支架對于脂肪源干細胞定向分化為軟骨細胞具有一定的促進作用。

Kim等 [6]將脂肪源干細胞附著于PLGA微球上直接注射入裸鼠體內(nèi)，結果發(fā)現(xiàn)，與單獨注射PLGA微球相比，ASCs-PLGA復合物更有利于促進肌肉組織的再生，表明PLGA支架有助于脂肪源干細胞向肌肉組織的定向分化。

盡管PLGA已廣泛用于組織工程的研究，但仍需進行改進，例如降解時間長、質(zhì)地脆等缺點。對于其在臨床的應用，還需觀察其免疫原性，并進一步研究其在體內(nèi)降解時間的調(diào)控等。

2.2　生物陶瓷支架

生物陶瓷主要由鈣、磷組成，是骨組織中的主要無機成分，具有良好的生物相容性和骨傳導性，植入骨斷端易形成骨性結合。該材料可加工成多孔結構，有利于細胞長入和營養(yǎng)物質(zhì)以及代謝產(chǎn)物出入。此外，其輕度溶解所形成的高鈣離子層及微堿性環(huán)境，可有效促進成骨細胞的粘附、增殖和基質(zhì)分泌，且該材料中的微量氟元素能促進成骨細胞合成DNA，并提高堿性磷酸酶的活性。因此，生物陶瓷主要應用于骨組織工程支架材料。

目前，脂肪源干細胞組織工程中應用較為廣泛的生物陶瓷有鈣磷鹽陶瓷和生物活性玻璃（Bioactive glass，BG）。

其中，鈣磷鹽陶瓷主要包括羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）、磷酸三鈣（Tricalcium phosphate，TCP）以及雙相鈣磷陶瓷（HA/TCP）。HA具有多孔結構和骨誘導性，不僅可引導新生骨沿植入體界面向植入體內(nèi)生長，而且能通過與接觸的骨面形成磷灰石層而達到良好的骨性結合 [7]，常作為骨代用品廣泛應用于臨床。但其作為骨組織工程支架材料時，由于其降解速度非常慢，從而影響了新骨的長入和后期的構建。同時，它也存在著脆性大，柔韌性不夠等缺點。TCP與HA最大的不同，就是它具有明顯的生物可吸收性，屬于生物可降解吸收的陶瓷類材料。盡管如此，由于其降解和吸收速度與骨形成速度不匹配，隨著降解的進行，強度大幅度下降。

BG是硅酸鹽性質(zhì)的生物活性材料，主要成分包括SiO 2、Na 2O、CaO、P 2O 5等。它和骨組織及軟組織之間具有良好的生物活性和生物相容性。BG表面部分在水溶液中可形成具有高表面積的水化氧化硅層及碳酸鹽羥基磷灰石（HA）層，能誘導更迅速的骨修復與再生。此外，BG還具有良好的止血效果及抗菌能力 [8-9]。盡管如此，BG同樣存在脆性大，抗彎強度差，以及其含有的硅成分不能降解等不足。

鑒于生物陶瓷材料在骨修復領域中的獨特優(yōu)勢，國內(nèi)外學者通過將其和有機高分子聚合物材料復合，利用各種復合材料在性能上互補，使生物陶瓷材料在骨組織工程骨修復領域得以推廣應用 [10]。

Hao等 [11]將β-TCP和PLGA共聚物構建成多孔復合材料。研究發(fā)現(xiàn)，該復合材料的親水性可隨β-TCP成分的增加而增加，同時β-TCP的引入也可以代償聚合物降解引起的pH值下降，有助于細胞粘附，防止無菌性炎癥反應的發(fā)生；此外，PLGA共聚物也有助于改善陶瓷類材料的脆性，加強復合支架的剛性。該實驗利用Ⅰ型膠原凝膠（CollagenⅠgel，COL）模擬骨細胞的細胞外基質(zhì)，使兔脂肪源干細胞（Rabbit adipose-derived stem cells，rASCs）懸浮其中，然后種植到多孔PLGA-β-TCP復合支架中。結果發(fā)現(xiàn)，與單純rASCs/PLGA-β-TCP組相比，在體外培養(yǎng)2周后，加入膠原凝膠組（rASCs-COL/PLGA-β-TCP組）的堿性磷酸酶活性和細胞外基質(zhì)礦化程度都明顯增高；體內(nèi)移植8周后，加入rASCs-COL/PLGA-β-TCP組的鈣化程度在影像學檢測下很明顯，且已有骨小梁形成，而單純干細胞-復合支架組無明顯鈣化，且僅發(fā)現(xiàn)有骨樣組織形成；此外，經(jīng)檢測，體內(nèi)移植8周后，rASCs-COL/PL鄄GA-β-TCP組新骨形成的面積可達移植物總面積的42.31%，而rASCs/PLGA-β-TCP組卻僅達7.88%。由此可見，加入Ⅰ型膠原后能夠顯著提高材料與組織細胞的相互作用，明顯促進干細胞向骨細胞分化以及均勻骨組織的形成。

有研究發(fā)現(xiàn)，ASCs種植到BG支架后的3 h內(nèi)無細胞死亡，2周后活細胞的比例更高，并且均勻粘附和分布在整個支架上，從而證明BG支架材料與ASCs具有良好的相容性 [12]。此外，BG支架具有有效促ASCs增殖和向骨細胞分化的作用，提示兩者的結合在骨修復領域中具有巨大潛能。

Haimi等 [13]對PLA-β-TCP和PLA-BG復合支架對ASCs生存、分布、增殖和向成骨分化作用進行了比較。體外培養(yǎng)2周后，發(fā)現(xiàn)PLA-β-TCP復合支架上ASCs的DNA含量以及堿性磷酸酶的活性明顯高于PLA-BG復合支架組，提示PLA-β-TCP在促ASCs增殖和成骨分化方面具有明顯優(yōu)勢。

2.3　納米支架

納米材料是上世紀80年代興起的，是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍（1～100 nm）或由它們作為基本單元構成的材料。納米材料具有3個共同結構特點：①尺寸在納米量級；②有大量的界面或自由表面；③各納米單元之間存在著或強或弱的相互作用。由于這些結構上的特殊性，納米材料具有一些獨特的效應，包括尺寸效應和表面（界面）效應。

由納米材料制造的組織工程納米支架已經(jīng)顯示出非常誘人的前景。因為細胞與細胞的信息傳遞以及細胞的功能完成都與胞外的基質(zhì)環(huán)境（ECM）密不可分，而組織工程納米支架的ECM就是由非常復雜的納米級纖維網(wǎng)絡構成的，因此與天然ECM結構相接近的三維納米纖維支架能夠充分模擬體內(nèi)微環(huán)境，從而具備生物功能，實現(xiàn)與肌體組織的完全整合。此外，納米支架材料的比表面積巨大，能提供大量的細胞接觸點，使單位體積內(nèi)的細胞數(shù)量增加，并改善蛋白質(zhì)吸附，有利于生長因子的釋放 [14-16]。同時，研究還表明，與傳統(tǒng)支架相比，納米級的生物支架材料更有利于細胞的粘附、增殖、分泌和生長 [17]。

目前，納米結構生物材料主要包括由納米粒子直接構成的材料和通過特殊方法將表面處理成具有納米結構的材料。這些納米材料可以是無機的，也可以是有機的。

Lin等 [18]利用β-TCP和HA成功制備了可降解的納米雙相磷酸鈣復合支架（β-TCP∶HA＝30∶70），并以此來檢測納米復合支架對ASCs向成骨方向分化的影響。結果發(fā)現(xiàn)，植入裸鼠體內(nèi)4周后，在支架表面和多孔結構中開始出現(xiàn)骨樣結構，并有大量的細胞外基質(zhì)產(chǎn)生；8周后出現(xiàn)白色、質(zhì)硬的骨樣組織，且均勻分布于整個支架的腔隙結構中，并伴有大量的血管產(chǎn)生。而單純納米復合支架組移植后4周時未見骨樣組織形成，且8周后出現(xiàn)的少量骨組織在腔隙結構中也呈不均勻分布。實驗證實，納米復合材料在形成多孔結構的同時能夠明顯改善支架的力學性能，且與ASCs相容性良好，同時也能促進ASCs的粘附、增殖和分化。

McCullen等 [19]同樣證實由多壁碳納米管和聚乳酸納米纖維構建的靜電納米復合支架與ASCs具有良好的相容性，有利于干細胞的生長、增殖和分布。研究表明，ASCs種植到靜電納米復合支架后，14 d內(nèi)均表現(xiàn)出良好的生長活性，并且在掃描電鏡下呈均勻分布，而在單純支架上則呈隨機分布狀態(tài)，這可能與納米支架亞微米級的孔徑有關。

雖然目前納米纖維支架材料的制備和研究已經(jīng)取得了一定的成果，但是如何優(yōu)化制備工藝、縮短材料制備周期、降低材料加工成本、增強材料的安全性能、提高支架材料的孔隙率和控制孔徑的大小及其分布等問題，還有待進一步的研究。

3　展望

近幾年來，組織工程研究獲得了很大發(fā)展，但種子細胞的來源尚受到諸多限制，而ASCs蘊藏著較好的臨床應用前景。各種人工合成支架材料在脂肪源干細胞組織工程中的應用取得了很大的進展。隨著生物學、細胞學及生物材料學等相關學科的發(fā)展，如何開發(fā)新型的仿生化、智能化組織工程材料，即通過分子設計以制備符合人體細胞外基質(zhì)需要的，能對生理環(huán)境變化產(chǎn)生響應的，可在分子水平上激活基因誘導細胞組織分化，實現(xiàn)器官修復和組織修復的新一代生物可降解組織工程支架材料，是組織工程支架材料進一步發(fā)展所面臨的挑戰(zhàn) [20-21]。因而需要進一步加強相關學科間的相互滲透、交叉和合作，在不斷開發(fā)和改進組織工程支架材料的同時，更要注重細胞與生物材料相互作用的研究。