胃癌的基因治療研究

310007 南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院 田雅軍 徐展 呂珍

·綜述·

胃癌的基因治療研究

310007 南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院 田雅軍 徐展 呂珍

腫瘤從本質(zhì)上說(shuō)是一種多基因病，其發(fā)病涉及多階段的基因事件，最終導(dǎo)致正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變成腫瘤細(xì)胞。腫瘤的基因治療是通過(guò)轉(zhuǎn)入核苷酸序列進(jìn)入正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞直接死亡，改變針對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)，或糾正某些基因的異常，逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性進(jìn)程，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療和化療的敏感性，提高正常組織細(xì)胞對(duì)放、化療毒副反應(yīng)的耐受力，最終達(dá)到縮小和消滅腫瘤的目的?；蛑委熤凶罨镜膯?wèn)題是：①如何選擇目的基因。②將目的基因高效地導(dǎo)入載體與靶細(xì)胞，并在其中表達(dá)。③能有效地回輸至體內(nèi)，并發(fā)揮作用[1]。胃癌為一高發(fā)、高惡性度、預(yù)后不良的惡性腫瘤，長(zhǎng)期以來(lái)臨床手術(shù)切除及輔助性化療、放療措施的應(yīng)用，并沒(méi)有帶來(lái)滿(mǎn)意的生存率，其死亡率在我國(guó)居惡性腫瘤的首位。胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的基因改變近年來(lái)受到重視，如何用基因方法或以基因作為靶點(diǎn)來(lái)防治胃癌亦成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。本文對(duì)近幾年國(guó)內(nèi)外胃癌的基因治療進(jìn)展作如下綜述。

1 胃癌發(fā)病的分子基礎(chǔ)[2]

1.1 抑癌基因的變化①p53基因的錯(cuò)義突變、框架移位和雜合性缺失(LOH)，在胃癌和腸化異型增生病變中被發(fā)現(xiàn)。②APC基因在20%～50%胃癌中產(chǎn)生突變，APC突變出現(xiàn)在胃癌的啟動(dòng)早期，其LOH在彌漫型胃癌中有較高發(fā)生率，提示其基因產(chǎn)物可影響細(xì)胞黏附能力和移動(dòng)性。③DCC基因表達(dá)的降低與黏膜細(xì)胞的黏附特性改變及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)失控有關(guān)，其LOH可在50%腸型胃癌中發(fā)現(xiàn)。

1.2 癌基因的變化①bcl-2基因過(guò)度表達(dá)時(shí)可抑制凋亡，并在上皮細(xì)胞的永生化中起作用，它可參與腸型胃癌的早期啟動(dòng)。②c-erbB2過(guò)度表達(dá)在90%腸型胃癌中出現(xiàn)。③c-met和k-sam與彌漫型胃癌有關(guān)，c-met過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。

1.3 其他分子改變CD44基因的變異、細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)節(jié)因子p21和p27的表達(dá)缺失、端粒酶的活性陽(yáng)性、E-鈣粘蛋白基因的LOH和突變等常在胃癌中被檢測(cè)到。

2 胃癌相關(guān)基因[3]

2.1 癌基因已知與胃癌相關(guān)的癌基因有:c-myc，ras，hst，c-erbB-2，k-sam，n-myc，met，p53（突變型）等。它們通過(guò)點(diǎn)突變、擴(kuò)增或易位在腫瘤的啟動(dòng)、促癌以及進(jìn)展階段過(guò)度表達(dá)，引起胃黏膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化和無(wú)限制的增殖，最終導(dǎo)致胃癌的形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)化。在各種癌基因中ras基因特別是h-ras基因與胃癌的關(guān)系比較密切，其所編碼的蛋白質(zhì)rasp12具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的功能，它的異常表達(dá)對(duì)細(xì)胞惡變和胃癌的惡性表型起著重要作用。此外，還有一些分子與胃癌細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移等惡性行為有關(guān)。如增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、端粒酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、免疫抑制酸性蛋白(IAP)等。

2.2 抑癌基因抑癌基因存在于正常細(xì)胞中，是細(xì)胞正常增殖的穩(wěn)定因素，Rb基因是最早發(fā)現(xiàn)的人體抑癌基因。此后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種抑癌基因，和胃癌有關(guān)的有p53，DCC，APC，MCC等。p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)的與人類(lèi)腫瘤相關(guān)性最高的基因，定位于17號(hào)染色體短臂上。野生型p53基因（AdCA p53）在細(xì)胞損傷修復(fù)過(guò)程中，監(jiān)視著基因組DNA的完整性。當(dāng)細(xì)胞受到射線(xiàn)或某些藥物作用而發(fā)生DNA損傷時(shí)，p53基因所編碼的蛋白能使細(xì)胞分裂停止在G1/S期，使細(xì)胞充分修復(fù)DNA的損傷使之恢復(fù)正常。倘不能恢復(fù)，野生型p53基因還能啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡過(guò)程從而引導(dǎo)細(xì)胞的程序性死亡，阻止具有癌變傾向的突變細(xì)胞出現(xiàn)。但野生型p53基因很容易發(fā)生突變，轉(zhuǎn)變成突變型p53基因。突變型p53基因不但喪失了抑制腫瘤發(fā)生的作用，反而具有致癌作用，成為癌基因。定位于18號(hào)染色體長(zhǎng)臂的DCC基因，定位于5號(hào)染色體短臂的APC基因和MCC基因也是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，它們的缺乏或突變常見(jiàn)于結(jié)、直腸癌，也可在胃癌中發(fā)現(xiàn)。此外nm23和p16基因也被認(rèn)為是腫瘤抑制基因。

3 胃癌的基因治療策略

3.1 基因置換基因治療基因置換是轉(zhuǎn)移外源正?；蚧虺；罨幕蛉〈惓Ｓ腥毕莸哪[瘤抑制基因。目前在胃癌基因治療研究中最多的是p53和GCF兩個(gè)抑癌基因。

研究較深入的是p53基因置換治療。Steele等[4]報(bào)告有大約60%胃癌患者的腫瘤細(xì)胞有p53基因的點(diǎn)突變，由于p53基因表達(dá)的核蛋白被認(rèn)為在細(xì)胞DNA損傷后的細(xì)胞調(diào)控中處于中心地位，因此應(yīng)用野生型p53基因進(jìn)行基因置換治療胃癌極具吸引力。Ohashi等[5]研究了重組腺病毒介導(dǎo)的野生型p53基因轉(zhuǎn)染治療胃癌細(xì)胞株MKN1、MKN7、MKN28、MKN45、TMK-1在體外和動(dòng)物體內(nèi)的作用，結(jié)果表明，導(dǎo)入了野生型P53基因的人胃癌細(xì)胞株生長(zhǎng)明顯受抑制，而未導(dǎo)入的表現(xiàn)為p53基因的細(xì)胞株則無(wú)此現(xiàn)象；流式細(xì)胞儀和DNA檢測(cè)表明，AdCA p53對(duì)胃癌細(xì)胞的機(jī)制是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，野生型p53基因置換后的腫瘤細(xì)胞能恢復(fù)對(duì)放療、化療的敏感性[6]。因此，p53基因置換治療胃癌是一種可行的有效方法。GCF基因置換治療：GCF基因是一種與人類(lèi)胃癌有密切關(guān)系的抑癌基因，其結(jié)合于表皮生長(zhǎng)因子受體基因啟動(dòng)子上富含GC核苷酸序列的特異性區(qū)域，能夠抑制表皮生長(zhǎng)因子受體基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ等其他生長(zhǎng)因子的表達(dá)。Kitadai等[7]將GCF基因轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株TMK-1和MKN-28，結(jié)果被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株不能在無(wú)血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，動(dòng)物試驗(yàn)同樣證實(shí)轉(zhuǎn)染了該基因的胃癌細(xì)胞接種于裸鼠皮下，其生長(zhǎng)明顯減慢。

3.2 反義核酸基因治療反義基因治療就是應(yīng)用反義核酸在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平阻斷某些異常基因的表達(dá)，以期阻斷瘤細(xì)胞內(nèi)的異常信號(hào)傳導(dǎo)，使瘤細(xì)胞進(jìn)入正常分化軌道或引起細(xì)胞凋亡，或抑制自分泌生長(zhǎng)因子的分泌，封閉其受體以改變腫瘤的生物學(xué)特性達(dá)到治療腫瘤的目的。

增殖細(xì)胞核抗原(PCAN)是一種能通過(guò)δ-DNA聚合酶誘導(dǎo)DNA合成的核蛋白，其基因表達(dá)在胃癌細(xì)胞中顯著增高，并與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此利用反義基因技術(shù)，合成PCAN的反義cDNA與其相互作用，以抑制或封閉其表達(dá)。Sakakura等[8]構(gòu)建了反義寡核苷酸的真核表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染入7種不同的胃癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞與親本細(xì)胞相比，其生長(zhǎng)速度均有不同程度的抑制，軟瓊脂集落形成能力減弱，活性降低，并在10～40 mmol/L的濃度下具有劑量、效應(yīng)關(guān)系。這一結(jié)果表明，PCAN與胃癌細(xì)胞的異常增殖有關(guān)，通過(guò)反義技術(shù)抑制PCAN基因的表達(dá)可對(duì)胃癌細(xì)胞的惡性表型產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)作用，達(dá)到控制胃癌生長(zhǎng)作用。因此采用反義技術(shù)來(lái)封閉PCAN的表達(dá)不失為胃癌基因治療的一條途徑。Bcl-2基因亦是一種細(xì)胞凋亡抑制基因，它是通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+通道及IL-2β轉(zhuǎn)化酶(ICE)的表達(dá)和釋放而抑制細(xì)胞凋亡，并與bax、TNF、Fas的結(jié)合與調(diào)節(jié)有關(guān)，它雖不促進(jìn)細(xì)胞增殖，但可明顯延長(zhǎng)細(xì)胞的存活時(shí)間，在胃癌中常有過(guò)度的表達(dá)。肖冰等[9]采用反義核酸技術(shù)構(gòu)建Bcl-2反義真核表達(dá)載體(PDOR-Bcl-2-cDNA)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC-7901，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染反義重組基因的胃癌細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)明顯減少，說(shuō)明反義Bcl-2可以有效阻止胃癌細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)。c-myc癌基因是一種細(xì)胞凋亡抑制基因，其蛋白產(chǎn)物是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的一種重要轉(zhuǎn)錄激活因子。在多數(shù)情況下，基因表達(dá)是細(xì)胞分裂周期中進(jìn)入S期所必需的。腫瘤細(xì)胞常伴有基因表達(dá)失控。Chen等[10]在體內(nèi)及體外用重組反義c-myc腺病毒治療人胃癌的研究發(fā)現(xiàn)，在SGC-7901細(xì)胞Ad-Asc-myc強(qiáng)烈抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)胃癌的基因治療來(lái)說(shuō)，其具有潛在的臨床使用價(jià)值。

3.3 免疫基因治療由于在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在著機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受狀態(tài)，而這種狀態(tài)可能是既源于腫瘤細(xì)胞本身的免疫原性不強(qiáng)（如MHC表達(dá)不足），也可源于抗原遞呈細(xì)胞(APC)不能提供足夠的共刺激信號(hào)（如B7）或機(jī)體免疫因子分泌不足，或腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)機(jī)體的免疫抑制?；蛎庖咧委煹闹饕瓌t是提高宿主對(duì)腫瘤的免疫力?？梢詫⒛承┘?xì)胞因子或黏附分子的基因轉(zhuǎn)染到機(jī)體免疫細(xì)胞或癌細(xì)胞中，以提高機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和反應(yīng)能力。目前腫瘤細(xì)胞靶向的細(xì)胞因子基因治療研究較多，該療法以主動(dòng)性免疫治療為基礎(chǔ)，即將細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞中，制備出免疫原性更強(qiáng)的新型瘤苗，以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生顯著的抗腫瘤免疫功能從而達(dá)到治療腫瘤的目的。目前用于胃癌基因治療的細(xì)胞因子主要有TNF，IL-2，4，6，IFL-γ，GM-CSF等，均收到不同程度的治療效果。周志強(qiáng)等[11]構(gòu)建人IL-2及IL-4真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表達(dá)有活性的IL-2及IL-4，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)不改變胃癌細(xì)胞的體外生長(zhǎng)特性，并能增強(qiáng)LAK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，降低或消除胃癌細(xì)胞的體內(nèi)致瘤性，并且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞經(jīng)大劑量射線(xiàn)照后，仍可以持續(xù)分泌IL-4，3～4周。證明該種瘤苗的安全性。Matsubara等[12]用逆轉(zhuǎn)錄病毒分別將IL-2，IL-4及GM-CSF基因?qū)胛赴┘?xì)胞后，觀(guān)察射線(xiàn)對(duì)這些細(xì)胞代謝及細(xì)胞因子分泌的影響，所有細(xì)胞在接受6 Gy照射后細(xì)胞代謝部分抑制，劑量為20 Gy時(shí)完全抑制細(xì)胞代謝，而細(xì)胞因子的分泌則不受影響，即使在60 Gy照射后仍可檢測(cè)到有細(xì)胞因子分泌，這些特性對(duì)于設(shè)計(jì)新型瘤苗將是非常有益的。

3.4 自殺基因治療人們將正常細(xì)胞的程序性死亡稱(chēng)為細(xì)胞自殺(cell suicide)，隨著對(duì)細(xì)胞自殺機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)某些來(lái)自病毒或細(xì)菌的基因的表達(dá)產(chǎn)物可將原先對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)毒性或極低毒性的藥物轉(zhuǎn)換成毒性產(chǎn)物，從而導(dǎo)致這些細(xì)胞的死亡。因此，將這類(lèi)基因轉(zhuǎn)入某一靶細(xì)胞，使之對(duì)某些藥物有特別的敏感性，利用這些藥物使其死亡，這類(lèi)基因被稱(chēng)為“自殺基因”。由于自殺基因的表達(dá)產(chǎn)物大多為將無(wú)毒性前體轉(zhuǎn)換為毒性產(chǎn)物的酶類(lèi)，故又稱(chēng)為“前藥轉(zhuǎn)換酶基因”。這種治療稱(chēng)為腫瘤的“自殺基因”治療。目前，已發(fā)現(xiàn)和克隆的“自殺基因”有多種，如單純皰疹病毒的tk基因(HSV-tk)、胞嘧啶脫氨酶基因(CD)、細(xì)胞色素P-450基因等，其中HSV-tk和CD是目前應(yīng)用最多的基因。Yoshida等[13]通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)HSV-tk轉(zhuǎn)染人胃癌TMK-1細(xì)胞株，再予以丙氧鳥(niǎo)苷(GCV)后，該胃癌細(xì)胞株的增殖明顯受到抑制。Tanaka等[14]將癌胚抗原(CEA)特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子組成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列插入已經(jīng)含HSV-tk的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體后轉(zhuǎn)染至表達(dá)CEA胃癌細(xì)胞的效率大大提高。與應(yīng)用常規(guī)啟動(dòng)子構(gòu)建的HSV-tk相比，CEA啟動(dòng)子和增強(qiáng)子構(gòu)建的HSV-tk轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后應(yīng)用GCV治療，可明顯提高其對(duì)表達(dá)CEA胃癌細(xì)胞的殺傷作用[15]。40%的胃癌表達(dá)CEA，因此這些表達(dá)CEA的胃癌細(xì)胞株對(duì)該治療方法極為敏感。Lan等[16]以帶有CEA啟動(dòng)子的腺病毒為載體，將CD轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株MKN-45后接種于小鼠，對(duì)荷瘤小鼠全身性氟尿嘧啶(5-FU)治療，結(jié)果移植瘤生長(zhǎng)顯著受抑，荷瘤小鼠存活期明顯延長(zhǎng)，5-FU的不良反應(yīng)較對(duì)照組明顯減輕。

3.5 端粒酶的基因治療端粒酶存在于各種惡性腫瘤細(xì)胞中，它具有復(fù)制染色體末端DNA，延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度和維持細(xì)胞增殖能力的作用，它的活化是惡性腫瘤細(xì)胞無(wú)限制增殖的重要基礎(chǔ)。楊金亮等[17]將人端粒酶RNA(hTR)基因反向重組真核表達(dá)載體pcl-neo中，轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯減慢，軟瓊脂中無(wú)克隆形成，在1×107個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種到裸鼠皮下均無(wú)腫瘤形成，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞p21基因表達(dá)增高，p27、Bcl-2和c-myc基因的表達(dá)下降。Shay等[18]對(duì)3 500例各種不同的腫瘤及其正常組織中端粒酶活性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞表達(dá)端粒酶，而正常組織中端粒酶多呈陰性，從而認(rèn)為端粒酶的活化穩(wěn)定了腫瘤細(xì)胞嚴(yán)重縮短的端粒，使過(guò)度增殖的細(xì)胞惡性變或永生化，而缺乏端粒酶的細(xì)胞則很快死亡。文獻(xiàn)研究表明胃癌中端粒酶陽(yáng)性率高達(dá)92.3%，而正常胃黏膜中無(wú)端粒酶表達(dá)，因此端粒酶不僅可以作為腫瘤的診斷指標(biāo)，更可以作為腫瘤基因治療的靶位。

3.6 耐藥基因治療各種腫瘤包括胃癌在內(nèi)對(duì)化療藥物產(chǎn)生多耐藥性及大劑量化療藥物對(duì)骨髓的抑制作用是目前臨床化療失敗的主要原因。腫瘤的多耐藥表現(xiàn)為對(duì)結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制及作用部位各不相同的化療藥的交叉耐藥。近年來(lái)研究較多的是P-糖蛋白和編碼其多耐藥基因MDR1。P-糖蛋白是分布在細(xì)胞膜上的正常糖蛋白。暴露于多種毒物環(huán)境的組織細(xì)胞，如消化系組織細(xì)胞，在生理?xiàng)l件下就含有較多的P-糖蛋白。P-糖蛋白是一種能量依賴(lài)藥物外排泵，以ATP作為能源，將某些化學(xué)藥物泵出細(xì)胞外。目前發(fā)現(xiàn)與P-糖蛋白有類(lèi)似作用的尚有多種耐藥相關(guān)蛋白(MRP)及肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)。腫瘤細(xì)胞過(guò)度表達(dá)，P-糖蛋白或MRP能減少細(xì)胞內(nèi)藥物聚積或可變藥物在細(xì)胞內(nèi)的分布而降低化療效果。對(duì)MDR的特性盡可能地保護(hù)骨髓組織免受化療藥物的抑制。將MDR轉(zhuǎn)入造血干細(xì)胞中可以保護(hù)荷瘤宿主抵抗大劑量化療所致的損傷。這種基因治療方法可以很好的增加腫瘤化療的效果。

4 胃癌基因治療問(wèn)題和展望

腫瘤的基因治療是隨分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展而在近年興起的一種新的治療方法。胃癌的基因治療目前只在于動(dòng)物試驗(yàn)研究，還未在臨床上進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。其主要原因，第一是由于技術(shù)的復(fù)雜性，很難制成生物制品來(lái)用于臨床治療，第二是基因治療中病毒載體的安全性問(wèn)題尚未解決，第三靶細(xì)胞種類(lèi)的選擇，基因表達(dá)水平對(duì)基因治療效果以及患者本身的影響問(wèn)題。今后胃癌基因治療的發(fā)展方向應(yīng)是：①加強(qiáng)對(duì)胃癌基因變化規(guī)律的認(rèn)識(shí)，針對(duì)關(guān)鍵突變基因，運(yùn)用基因置換和反義核酸等基因治療策略。②改進(jìn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)一種更簡(jiǎn)單、安全有效的載體，實(shí)施基因定位導(dǎo)入，提高轉(zhuǎn)導(dǎo)率和外源基因的表達(dá)率。③進(jìn)一步擴(kuò)大基因受體細(xì)胞種類(lèi)的篩選，提高受體細(xì)胞的擴(kuò)增。

胃癌的基因治療將來(lái)成為腫瘤綜合治療的一部分，可以提高化療、放療的敏感性，對(duì)減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移起一定作用，甚至是明顯的作用。

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