白腐真菌在木質(zhì)素微生物降解中的作用

范 寰 梁軍峰 趙 潤(rùn) 張金鳳 張洪生

摘要:對(duì)木質(zhì)素降解的研究進(jìn)展、白腐真菌對(duì)木質(zhì)素降解的機(jī)理以及白腐真菌在飼料資源開發(fā)中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述,并對(duì)白腐真菌在木質(zhì)素降解中的發(fā)展方向做了展望。

關(guān)鍵詞:白腐真菌;木質(zhì)素;降解;木質(zhì)素降解酶

中圖分類號(hào):S816.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:ADOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.05.007

Role of White Rot Fungi in Microbial Degradation of Lignin

FAN Huan1,2,LIANG Jun-feng3,ZHAO Run3,ZHANG Jin-feng3,ZHANG Hong-sheng3

(1.Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Tianjin 300112,China;2.Tianjin Research Center of Agricultural Biotechnology,Tianjin 300192,China;3.Agro-environmental Protection Institute,Ministry of Agriculture of China,Tianjin 300191,China)

Abstract:In this article, the development in lignin degradation and the degradation mechanism by white rot fungi and the application of white-rot fungus in animal feeds production were reviewed. And an exploration of future technical and strategic improvements in lignin biodegradation by white rot fungi was respected.

Key words:white rot fungi;lignin;degradation;ligninolytic enzymes

白腐真菌(white rot fungi)是指著生在木材上,菌絲穿入木質(zhì),侵入木質(zhì)細(xì)胞腔內(nèi),能釋放降解木質(zhì)素和其他木質(zhì)組分的酶,以降解木材中的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素,引起木質(zhì)白色腐爛的絲狀真菌的集合。白腐真菌的種類很多,絕大多數(shù)為擔(dān)子菌,少數(shù)為子囊菌。主要分布在革蓋菌屬(Coriolus)、臥孔菌屬(Poria)、原毛平革菌屬(Phanerochaete)、側(cè)耳屬(Pleurotus)及煙管菌屬(Sjekandera)等[1]。白腐真菌中研究歷史最久、關(guān)注最多、研究最透的是黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium Burdsal)[2]。白腐真菌是已知的唯一能在純系培養(yǎng)中有效地將木質(zhì)素降解為CO2和H2O的一類微生物。近半個(gè)世紀(jì),白腐真菌所具有的獨(dú)特的生理生化機(jī)制和強(qiáng)大的降解代謝能力,使其受到許多研究者的高度關(guān)注。

1木質(zhì)素降解的研究

木質(zhì)素是自然界中除了纖維素外的第二大聚合物,它不僅對(duì)農(nóng)業(yè)、工業(yè)、環(huán)境有著重要的影響,也與人們的生活息息相關(guān),是一種有價(jià)值的潛在能源。飼料中的粗纖維主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素,很難被動(dòng)物消化道產(chǎn)生的酶所消化吸收。其中反芻動(dòng)物瘤胃微生物可以部分降解纖維素、半纖維素,對(duì)于木質(zhì)素很難降解;而單胃動(dòng)物對(duì)于粗纖維各種成分的消化利用更為有限。研究表明,木質(zhì)素可以通過(guò)各種化學(xué)鍵與纖維素、半纖維素相連,形成更加復(fù)雜的物質(zhì)——木質(zhì)纖維素,因?yàn)槟举|(zhì)素的存在,導(dǎo)致粗纖維系統(tǒng)中纖維素、半纖維素的降解率降低,因此木質(zhì)素是影響飼料粗纖維消化率的限制因子。由于木質(zhì)素與半纖維素、纖維素之間相互混雜和交聯(lián),使得原可以被瘤胃微生物降解的纖維素及其它可消化營(yíng)養(yǎng)成分也難以被降解,因此降低木質(zhì)素含量、破壞其結(jié)構(gòu)單元之間連接的各種共價(jià)鍵,對(duì)于提高農(nóng)作物秸稈的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要意義。有試驗(yàn)證明,由于粗纖維對(duì)豬消化道消化液的稀釋作用,消化酶對(duì)底物的作用受到限制,從而降低了淀粉消化率。廖玉英[3]等研究發(fā)現(xiàn),隨著鵝日糧中粗纖維水平的增加,飼料轉(zhuǎn)化率和日增重顯著下降。

木質(zhì)素由3種以苯丙烷為主體的木質(zhì)素單體組成,包括愈創(chuàng)木基結(jié)構(gòu)、紫丁香基結(jié)構(gòu)和對(duì)羥苯基結(jié)構(gòu),也有認(rèn)為木質(zhì)素是由四種醇單體(對(duì)香豆醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇)形成的一種復(fù)雜酚類聚合物。木質(zhì)素單體通過(guò)醚鍵等化學(xué)鍵相連,形成具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大分子芳香族化合物。在植物細(xì)胞形成過(guò)程中,木質(zhì)素和纖維素、半纖維素等交聯(lián)沉積在細(xì)胞的初生壁和次生壁中,木質(zhì)素還可與多糖通過(guò)阿魏糖橋交聯(lián)從而影響了纖維多糖的微生物降解,木聚糖彼此交聯(lián)及與木質(zhì)素的交聯(lián)使細(xì)胞壁不易降解,只有低于50%的纖維部分可被動(dòng)物消化吸收。木質(zhì)素作為一種物理屏障降低了飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此,降低飼料細(xì)胞壁中木質(zhì)素含量,使木質(zhì)化細(xì)胞易被消化,則能顯著提高飼料的可消化性和利用率。

目前,木質(zhì)纖維素的處理方法大致可分為物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法以及生物法[4]。物理處理技術(shù)主要有:機(jī)械粉碎、微波、超聲波、高能電子輻射、熱解等。物理方法處理時(shí)間短,操作簡(jiǎn)單,但設(shè)備投資費(fèi)用高?；瘜W(xué)處理方法主要是:酸處理、堿處理、氧化處理、氨水浸泡處理、氨回收浸沒(méi)(ARP)處理、石灰處理等,但存在腐蝕和毒性等缺點(diǎn),易造成環(huán)境污染,需回收。生物法主要研究的有真菌(白腐菌、褐腐菌、軟腐菌)、基因工程菌、酶類(多酚氧化酶、漆酶、過(guò)氧化氫生成酶、苯醌還原酶)等。生物法具有能耗低、無(wú)污染、條件溫和等優(yōu)點(diǎn),但周期長(zhǎng)[5]。

2白腐真菌對(duì)木質(zhì)素降解機(jī)理的研究

2.1木質(zhì)素降解酶系的組成

白腐真菌所具有的降解木質(zhì)素的能力源于白腐真菌所產(chǎn)生的酶系統(tǒng),分解木質(zhì)素需要依靠一個(gè)復(fù)雜的胞外過(guò)氧化物酶系統(tǒng),這一系統(tǒng)主要由3種酶構(gòu)成:木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(Lip)、錳過(guò)氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac),另外還有其它幾種酶的綜合作用[6]。與降解有關(guān)的酶只有當(dāng)某些主要營(yíng)養(yǎng)物(如氮、碳、硫)限制時(shí)才形成。由于營(yíng)養(yǎng)限制使真菌應(yīng)答產(chǎn)生了對(duì)底物的降解系統(tǒng)[7]。

2.2白腐真菌木質(zhì)素降解酶系的降解機(jī)理[8]

降解是以自由基為基礎(chǔ)的鏈反應(yīng)過(guò)程。在有氧條件下,H2O2激活過(guò)氧化物酶,過(guò)氧化物酶觸發(fā)啟動(dòng)高度活性的自由中間體形成,繼而以鏈反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生許多不同自由基,促使底物氧化。這種自由基反應(yīng)是高度非特異性和無(wú)立體選擇性的,即白腐真菌與被降解底物并非酶與底物的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系,而是與一類乃至多類底物的關(guān)系[9]。

LiP和MnP均為血紅素蛋白,催化過(guò)程中依賴H2O2。一般認(rèn)為,LiP首先從木質(zhì)素或木質(zhì)素模型化合物中產(chǎn)生一個(gè)電子,形成陽(yáng)離子基團(tuán),進(jìn)而導(dǎo)致裂解反應(yīng),引起丙基側(cè)鏈Cα—Cβ鏈斷裂,后者再經(jīng)歷一系列非酶反應(yīng)產(chǎn)生各種終產(chǎn)物。

MnP既可氧化酚型結(jié)構(gòu)也可氧化非酚型結(jié)構(gòu),其能將Mn(II)氧化成Mn(III),而Mn(III)是氧化劑,可在離MnP活性位點(diǎn)一段距離的地方起作用,但不能氧化非苯酚結(jié)構(gòu),只能通過(guò)Cα芳基開裂和其他降解反應(yīng)氧化木質(zhì)素中約占10%的抗性更強(qiáng)的酚結(jié)構(gòu)。

Laccase是一種含銅多酚氧化酶,主要攻擊木質(zhì)素中的苯酚結(jié)構(gòu)單元,在反應(yīng)中,苯酚的核失去一個(gè)電子而被氧化,產(chǎn)生含苯氧基的自由活性基團(tuán),可導(dǎo)致Cα氧化、Cα—Cβ裂解和烷基芳香基裂解。由于Laccase同時(shí)具有催化解聚和聚合木質(zhì)素的作用,因此單獨(dú)存在時(shí)不能降解木質(zhì)素,只有同時(shí)存在MnP等其他酶,避免反應(yīng)產(chǎn)物重新聚合時(shí),才有較高的木質(zhì)素降解效率。漆酶可在僅有碳源存在的條件下由菌體分泌,并且具有780 mV氧化還原電位,在沒(méi)有H2O2和其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的存在下可催化有機(jī)污染物的氧化[10]。

3白腐真菌在飼料資源開發(fā)中的應(yīng)用

3.1白腐真菌提高秸稈飼料的品質(zhì)及利用率

農(nóng)作物秸稈營(yíng)養(yǎng)成分的特點(diǎn)是蛋白質(zhì)、可溶性碳水化合物、礦物質(zhì)的含量低,而粗纖維含量高達(dá)35%～40%,還含有6%～12%的木質(zhì)素,無(wú)氮浸出物達(dá)40%～50%。秸稈的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值主要取決于秸稈有機(jī)物的消化利用程度。在秸稈有機(jī)物中,纖維素、半纖維素和木質(zhì)素是微生物重要的分解對(duì)象,而木質(zhì)素由化學(xué)特性十分穩(wěn)定的化合物形式構(gòu)成,極難被一般微生物分解,動(dòng)物無(wú)法吸收利用。纖維素和半纖維素易被微生物或酶分解,但木質(zhì)素是纖維素的外圍基質(zhì),將纖維素緊緊包裹在其中,并且家畜瘤胃微生物缺乏降解木質(zhì)素的酶,從而阻礙了家畜對(duì)纖維素和半纖維素的有效利用,導(dǎo)致秸稈的消化率降低。因此,提高農(nóng)作物秸稈利用率的關(guān)鍵就是降解木質(zhì)素[11]。

白腐真菌可使秸稈中木質(zhì)素降解率達(dá)到20%~60%,纖維素和半纖維素降解率達(dá)到20%~40%,干物質(zhì)損失10%~40%。用白腐真菌發(fā)酵切碎的麥秸,1個(gè)月后不僅粗蛋白質(zhì)含量有所提高,且秸稈的消化率可提高2~3倍。用白腐真菌發(fā)酵稻草時(shí),發(fā)酵后其木質(zhì)素含量降低13.7%~29.9%。蛋白質(zhì)含量增加24.6%~72.4%。由于大部分木質(zhì)素被降解或破壞,秸稈質(zhì)地變?nèi)彳?適口性改善,明顯提高了秸稈的體外干物質(zhì)消化率(IVDMD)。

用20多種白腐真菌處理秸稈的研究表明:白腐真菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的種間變異,同時(shí)培養(yǎng)發(fā)酵的條件不同,處理秸稈的效果也不同。但是經(jīng)篩選和選育的優(yōu)良菌種,在適當(dāng)環(huán)境條件下,固體發(fā)酵能顯著地改善秸稈的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。檢測(cè)表明,最佳的白腐真菌能使秸稈體外降解率從40%提高到59%。白腐真菌處理的秸稈不僅營(yíng)養(yǎng)成分有極大提高,而且其酸度由未處理前的pH值 5.17降至4.10左右,呈水果香味,同時(shí)由于大部分木質(zhì)素被降解或破壞,秸稈質(zhì)地柔軟適性明顯改善[12]。

3.2混菌發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料

應(yīng)用白腐真菌處理秸稈,可以提高秸稈的利用率,但是一些降解產(chǎn)物仍得不到充分的利用。為此,科研人員利用白腐真菌降解秸稈木質(zhì)素的能力和其它微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料或單細(xì)胞蛋白(SCP)的能力,進(jìn)行混菌發(fā)酵。陳慶森等[13]以玉米秸稈為原料,利用多菌種混合發(fā)酵,經(jīng)測(cè)定發(fā)酵液中玉米秸稈的纖維素利用率達(dá)70%,粗蛋白質(zhì)得率在23%以上,大大提高了玉米秸稈的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。齊剛[14]以酒糟和稻草為基質(zhì)進(jìn)行混菌發(fā)酵,分別比較了白腐菌單菌發(fā)酵、酵母菌單菌發(fā)酵和二者混菌發(fā)酵對(duì)蛋白提高的影響。實(shí)驗(yàn)表明,混菌發(fā)酵對(duì)蛋白提高的貢獻(xiàn)最大。通過(guò)比較酵母菌不同接種時(shí)間,發(fā)現(xiàn)白腐菌培養(yǎng)20 d后接人酵母可使蛋白含量達(dá)到6.45%。

4白腐真菌降解木質(zhì)素的局限性和發(fā)展方向

白腐真菌以其獨(dú)特的生理生化機(jī)制和強(qiáng)大的降解代謝能力而成為木質(zhì)素降解研究的模式菌株。白腐真菌雖然是降解木質(zhì)素最有效的微生物,但由于其培養(yǎng)時(shí)受許多外部條件的影響,因此,目前大多數(shù)的研究還僅限于實(shí)驗(yàn)室的發(fā)酵處理。而且在自然狀態(tài)下,白腐真菌的定植緩慢,很難形成優(yōu)勢(shì)種群,這是該菌用于木質(zhì)素降解并進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化的最大障礙。目前,生物降解多采用混合發(fā)酵,但由于菌種的不同來(lái)源和相容性的差異,各個(gè)菌株之間營(yíng)養(yǎng)條件和生長(zhǎng)條件有所不同,使混合發(fā)酵降解率也受到限制,至今不能達(dá)到高降解的目的[15]。因此,篩選出高效低能耗的木質(zhì)素分解菌種以及能在飼料上迅速生長(zhǎng),且與雜菌在生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)中處于生物量的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的優(yōu)良菌種,并采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建具有木質(zhì)素降解基因和纖維素酶基因的工程菌[16,17],是未來(lái)的發(fā)展方向。隨著白腐真菌基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的進(jìn)展,其在畜牧業(yè)中將得到更廣泛的應(yīng)用,將為我國(guó)飼料資源的開發(fā)利用提供更廣闊的空間。

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