蘋果自交不親和基因PCR擴(kuò)增程序優(yōu)化v

陳 超 于葆杰 李保國

摘要:通過研究PCR反應(yīng)體系(DNA、Primer、Mg2+、dNTP、 Taq聚合酶、buffer)及退火溫度對(duì)蘋果自交不親和基因(S基因)擴(kuò)增結(jié)果影響的分析,構(gòu)建了適合于蘋果自交不親和基因的PCR擴(kuò)增程序的優(yōu)化體系。結(jié)果表明:在20 μL的反應(yīng)體系中,模板DNA的最適含量為40 ng,dNTP最適濃度為0.25 mmol/L,而Primer最適濃度為0.4 μmol/L,Mg2+的最適濃度為2.5 mmol/L,Taq聚合酶最適濃度為1 U,buffer最適濃度為1×buffer,最適退火溫度為50 ℃。

關(guān)鍵詞:蘋果;S基因;PCR體系優(yōu)化

中圖分類號(hào):S661.1; Q503文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A DOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.04.008

Optimized Study on PCR Amplification Procedure of the Apple Self-incompatibility Gene

CHEN Chao1,YU Bao-jie1,LI Bao-guo2

(1.Forestry Science Institute of Cangzhou,Cangzhou,Hebei 061001,China;2. Forestry College,Hebei Agricultural University,Baoding,Hebei071000,China)

Abstract:Through analyzing the effect of PCR system (DNA, Primer, Mg2+, dNTP, Taq polymerase, and buffer) and annealing temperature on amplification of apple self-incompatibility gene (s-gene), we constructed a optimized system of PCR amplification procedure which was fit for apple self-incompatibility gene. The result showed that the optimized content in 20 μL system contained 40 ng DNA template, 0.25 mmol/L dNTP, 0.4 μmol/L primer, 2.5 mmol/L Mg2+, 1 U Taq polymerase, 1×buffer, and the optimized annealing temperature was 50 ℃.

Key words: apple;s-gene;optimized PCR system

蘋果自交不親和是在長期的生物進(jìn)化過程中形成的自我保護(hù)機(jī)制。但是,對(duì)蘋果栽培生產(chǎn)卻有很大影響。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,查明蘋果的自交不親和是由S基因控制的[1]。利用PCR技術(shù)可以進(jìn)行特異基因的擴(kuò)增,但目前對(duì)蘋果S基因PCR擴(kuò)增的研究報(bào)道極少,采用常規(guī)的PCR反應(yīng)體系難以獲得較高濃度的產(chǎn)物,不能進(jìn)行正?；厥砧b定。因此,筆者對(duì)蘋果S基因PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行了優(yōu)化研究。

1材料和方法

1.1材料

2004年5月上旬,于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹標(biāo)本園采集富士蘋果新梢頂端完全展開的第1~2片幼葉,液氮速凍后置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

基因組DNA提取參照CTAB法[2],DNA質(zhì)量和濃度的檢測(cè)用薩姆布魯克[3]的方法。引物按Shogo matsumoto[4]的設(shè)計(jì)合成,其上游引物為:5'-TTTACGCAGCAATATCAG-3',下游引物為:5'-ACGTTCGGCCAAATA/CATT-3',由寶生物工程(大連)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系及熱循環(huán)條件在Ishimizu T[5]的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。在20 μL PCR反應(yīng)體系中,DNA模板含量設(shè)5,10,20,40,60,80 ng 6個(gè)濃度梯度;Mg2+濃度設(shè)1,1.5,2,2.5,3,3.5,4 mmol/L 7個(gè)濃度梯度;TaqDNA聚合酶設(shè)0.5,1,2.5,5,7,15 U 6個(gè)濃度梯度;dNTP濃度設(shè)0.1,0.15,0.2,0.25,0.3,0.4 mmol/L 6個(gè)濃度梯度;引物濃度分別設(shè)0.1,0.2,0.25,0.3,0.4,0.5 μmol/L 6個(gè)濃度梯度;buffer濃度設(shè)0.5×buffer、1×buffer、2×buffer、3×buffer、4×buffer、5×buffer 6個(gè)濃度梯度;退火溫度設(shè)41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52 ℃共12個(gè)溫度梯度。

2結(jié)果與分析

2.1不同DNA模板含量對(duì)蘋果S基因的PCR擴(kuò)增的影響

不同DNA模板含量對(duì)蘋果S基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。由此表明,在DNA模板含量5～40 ng都得到了較好的擴(kuò)增,說明DNA模板含量在此范圍內(nèi)對(duì)蘋果S基因PCR擴(kuò)增結(jié)果影響較小,5 ng即可滿足擴(kuò)增需要。隨著模板含量的增加,擴(kuò)增條帶的亮度有所增強(qiáng),以40 ng擴(kuò)增效果最好,當(dāng)DNA含量達(dá)到60～80 ng時(shí)擴(kuò)增條帶亮度變?nèi)跚覍挾茸冃?。因此認(rèn)為,進(jìn)行蘋果S基因的PCR擴(kuò)增時(shí)DNA模板含量以40 ng為宜。

2.2不同Mg2+濃度對(duì)蘋果S基因的PCR擴(kuò)增的影響 不同Mg2+濃度條件下蘋果S基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。由此表明,當(dāng)Mg2+濃度為1.0 mmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶少而且弱,隨著濃度的增加,特異性結(jié)合增強(qiáng),擴(kuò)增條帶越來越清晰;當(dāng)濃度達(dá)到4 mmol/L時(shí),特異性降低,出現(xiàn)一些非特異性條帶,使擴(kuò)增的條帶變寬;Mg2+濃度在1.5～3.0 mmol/L之間均能獲得清晰穩(wěn)定的條帶,以濃度在2.5 mmol/L最好。因此認(rèn)為,進(jìn)行蘋果S基因的PCR擴(kuò)增時(shí)Mg2+濃度以2.5 mmol/L為宜。

2.3不同dNTP濃度對(duì)蘋果S基因的PCR擴(kuò)增的影響

不同dNTP濃度對(duì)蘋果S基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示。由此表明,dNTP濃度從0.1～0.3 mmol/L均能擴(kuò)增清晰的條帶,以0.25 mmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶最清晰,濃度達(dá)0.4 mmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶變?nèi)酢Ｒ虼苏J(rèn)為,進(jìn)行蘋果S基因的PCR擴(kuò)增時(shí)dNTP濃度以0.25 mmol/L為宜。

2.4不同引物濃度對(duì)蘋果S基因的PCR擴(kuò)增的影響

不同引物濃度對(duì)蘋果S基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示。由此表明,引物濃度為0.1 μmol/L時(shí)沒有擴(kuò)增產(chǎn)物,濃度為0.2～0.3 μmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶不清晰,說明在引物濃度較低時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)物效率低;在0.3～0.4 μmol/L時(shí)較好,以0.4 μmol/L最佳。因此認(rèn)為,進(jìn)行蘋果S基因的PCR擴(kuò)增時(shí)引物濃度以0.4 μmol/L為宜。

2.5不同Taq聚合酶濃度對(duì)蘋果S基因的PCR擴(kuò)增的影響

不同Taq聚合酶濃度對(duì)蘋果S基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示。由此表明, Taq聚合酶濃度在0.5～1 U時(shí),能夠得到條帶清晰、特異性強(qiáng)的擴(kuò)增產(chǎn)物,以1 U時(shí)最佳;在0.25～15 U時(shí),有一些非特異性條帶得到了擴(kuò)增。因此認(rèn)為,進(jìn)行蘋果S基因的PCR擴(kuò)增時(shí)Taq聚合酶濃度以1 U為宜。

2.6不同buffer濃度對(duì)蘋果S基因的PCR擴(kuò)增的影響

不同buffer濃度對(duì)蘋果S基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示。由此表明,當(dāng)buffer濃度為0.5×buffer、1×buffer、2×buffer時(shí),能夠得到特異性強(qiáng)而且清晰的條帶。以后隨著buffer濃度的增加, PCR擴(kuò)增產(chǎn)率降低。1×buffer時(shí)條帶清晰,特異性好。因此認(rèn)為,進(jìn)行蘋果S基因的PCR擴(kuò)增時(shí)buffer濃度以1×buffer為宜。

2.7不同退火溫度對(duì)蘋果S基因的PCR擴(kuò)增的影響

不同退火溫度對(duì)蘋果S基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖7所示。由此表明,溫度在47 ℃以下時(shí)擴(kuò)增條帶輪廓不清且出現(xiàn)非特異性條帶;在48～50 ℃之間時(shí)出現(xiàn)了鮮明的譜帶,且特異性很強(qiáng);在51 ℃以上時(shí),得不到擴(kuò)增產(chǎn)物。試驗(yàn)結(jié)果說明,退火溫度太低,有條帶模糊不清或擴(kuò)增效率下降的趨勢(shì);而退火溫度太高,幾乎看不到擴(kuò)增產(chǎn)物?？梢?只有在溫度允許的范圍內(nèi),適當(dāng)提高退火溫度,可以提高PCR反應(yīng)的特異性,使擴(kuò)增條帶清晰。因此認(rèn)為,進(jìn)行蘋果S基因的PCR擴(kuò)增時(shí)退火溫度以50 ℃為宜。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明,蘋果S基因PCR最優(yōu)化反應(yīng)體系為:總體積20 μL時(shí),DNA模板含量為40 ng,Mg2+濃度為2.5 mmol/L,引物濃度為0.4 μmol/L, dNTP濃度為0.25 mmol/L,Taq聚合酶濃度為1 U,buffer濃度為:1×buffer,退火溫度為50 ℃。

PCR對(duì)DNA質(zhì)量要求不高[6],當(dāng)DNA模板含量在5～40 ng范圍內(nèi)均擴(kuò)增出清晰條帶,說明蘋果DNA模板含量在此范圍內(nèi)不會(huì)影響蘋果S基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果。但當(dāng)DNA含量超出此范圍以后,隨著DNA含量的提高,擴(kuò)增條帶不清晰。因?yàn)?當(dāng)DNA含量超過60 ng以后,由于引物濃度相對(duì)較少,在PCR反應(yīng)過程中高濃度的DNA對(duì)引物有競(jìng)爭作用,可能對(duì)引物有一定的分散效應(yīng),使擴(kuò)增產(chǎn)率降低。

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