生物農(nóng)藥固態(tài)發(fā)酵綜述

陳建幫 弓愛君 李紅梅 邱麗娜 曹艷秋 校 逸

摘要:從生物農(nóng)藥固態(tài)發(fā)酵中的發(fā)酵原料、條件控制、發(fā)酵設(shè)備、毒力檢測等方面對生物農(nóng)藥的固態(tài)發(fā)酵研究進行了綜述。

關(guān)鍵詞:固態(tài)發(fā)酵;生物農(nóng)藥;蘇云金芽孢桿菌

中圖分類號:TQ45文獻標(biāo)識碼:ADOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.06.018

Review on Solid State Fermentation of Bio-pesticide

CHEN Jian-bang1,GONG Ai-jun1,LI Hong-mei2,QIU Li-na1,CAO Yan-qiu1,XIAO Yi1

(1. Beijing University of Science and Technology,Beijing 100083,China;2.China National Measuring Science Research Institute,Beijing 100013,China)

Abstract:In this paper, current developments of solid state fermentation of bio-pesticide, including raw materials, conditions control, bioreactors and toxicity assays were reviewed.

Key words:solid state fermentation;bio-pesticide;Bacillus thuringiensis

生物農(nóng)藥一般是指自然界中存在的生物活體,如細(xì)菌、真菌、病毒等微生物或其產(chǎn)生的具有防治農(nóng)業(yè)病蟲、草、鼠害作用的生物活性物質(zhì)。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用生物農(nóng)藥替代化學(xué)農(nóng)藥,可以達到不污染環(huán)境、對人畜安全、防治對象不易產(chǎn)生抗藥性、不殺傷天敵、對生態(tài)鏈的影響小等目的。隨著生態(tài)農(nóng)業(yè)和有機農(nóng)產(chǎn)品市場的不斷發(fā)展,生物農(nóng)藥受到了越來越多的重視,并顯示出了強勁的發(fā)展勢頭[1,2]。

近年來,固態(tài)發(fā)酵工藝在生物農(nóng)藥工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用取得了進展。固態(tài)發(fā)酵是沒有或只有少量游離水存在,在具有可以滿足微生物生長代謝的一定濕度的固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)中進行的微生物發(fā)酵過程[3]。和傳統(tǒng)的深層液體發(fā)酵工藝相比,固態(tài)發(fā)酵具有培養(yǎng)基含水量低,所需反應(yīng)器體積小,產(chǎn)物濃度高,產(chǎn)品純化費用低,無廢水排放,污染物較少(屬于清潔生產(chǎn)技術(shù)),所需通氣壓力低、能耗少,培養(yǎng)基來源廣泛等優(yōu)越性[4],特別適合于發(fā)展中國家生物農(nóng)藥的有效生產(chǎn)[5,6]。利用固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的生物農(nóng)藥品種主要有細(xì)菌類殺蟲劑,如蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis),真菌類殺蟲劑白僵菌(Beauveria bassiana)、盾殼霉(Coniothyrium minitans)、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)等。其中蘇云金芽孢桿菌經(jīng)過百年的發(fā)展已成為目前世界上產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣的生物殺蟲劑[7]。

1生物農(nóng)藥固態(tài)發(fā)酵原料

固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)為微生物提供發(fā)酵所需的營養(yǎng)并且作為微生物細(xì)胞生長的載體。對微生物固態(tài)發(fā)酵過程中傳質(zhì)、傳熱和微生物的代謝過程產(chǎn)生影響[8]。固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)發(fā)酵原料的選擇不僅關(guān)系到發(fā)酵水平,而且和生產(chǎn)成本密切相關(guān)。目前生物農(nóng)藥固態(tài)發(fā)酵原料主要是工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品加工后的副產(chǎn)品及其廢棄物。這些原料來源廣泛、豐富,可以實現(xiàn)這些廢棄物的的資源化利用,又可以降低生物農(nóng)藥生產(chǎn)成本。

常用的發(fā)酵原料包括麥麩、米糠、黃豆粉餅、花生粉餅等。陳欣等[9]以麩皮為唯一固態(tài)發(fā)酵底物對盾殼霉的孢子生產(chǎn)進行了研究,通過對不同麩皮和小麥配比的底物的發(fā)酵結(jié)果進行比較,確定了利用麩皮作為唯一底物進行盾殼霉固態(tài)發(fā)酵可以達到較好的效果。陳欣等[10]還對以麩皮作為盾殼霉孢子固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)添加營養(yǎng)液的固態(tài)發(fā)酵進行了培養(yǎng)基優(yōu)化。Vimala Devi等[11]利用麥麩為主要原料,添加糖蜜和酵母浸膏作為補充碳源和氮源進行蘇云金芽孢桿菌的固態(tài)發(fā)酵研究,確定了一種便宜有效的蘇云金芽孢桿菌生產(chǎn)方式。孫翠霞等[12]采用正交試驗對蘇云金芽孢桿菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化,確定了固態(tài)培養(yǎng)基中麥麩、豆餅粉、玉米粉、酵母粉、米糠和無機鹽的最佳比例。

雖然麩皮、米糠等一直作為生物農(nóng)藥固態(tài)發(fā)酵常用原料,但是由于他們可以作為動物飼料和人類膳食纖維素的主要來源及其高溫滅菌后存在粘度增加、疏松度不夠、空隙小、后續(xù)接種困難等缺點,研究人員一直致力于尋找新的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)。

張怡等[13]嘗試以廢次煙草為固態(tài)發(fā)酵原料,用于蘇云金芽孢桿菌的固態(tài)發(fā)酵,實現(xiàn)了廢次煙草的綜合利用,獲得了質(zhì)量優(yōu)良的生物殺蟲劑。Adams等[14]研究利用肉雞產(chǎn)生的垃圾進行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蘇云金芽孢桿菌。陶玉貴等[15]以啤酒糟為主要原料,并添加了適當(dāng)?shù)挠衩追?、豆粕和無機鹽進行了蘇云金芽孢桿菌的固態(tài)發(fā)酵研究。楊超英等[16]用響應(yīng)面分析法對以啤酒糟為主要基質(zhì)的蘇云金芽孢桿菌培養(yǎng)基進行了優(yōu)化?；谑程檬ｏ埐藖碓吹膹V泛性及其中含有豐富的粗纖維、淀粉、粗蛋白及各種營養(yǎng)元素,弓愛君以食堂剩飯菜為發(fā)酵原料進行固態(tài)發(fā)酵,生產(chǎn)出了具有市場競爭力的蘇云金芽孢桿菌生物農(nóng)藥。

2發(fā)酵條件控制

在固態(tài)發(fā)酵的過程中如何成功控制水活度、溫度、pH值、通氣與傳質(zhì)等影響參數(shù)是制約固態(tài)發(fā)酵技術(shù)規(guī)模化應(yīng)用的重要問題[17]。

2.1水活度

水是微生物生長所必不可少的營養(yǎng)物質(zhì),是發(fā)酵的主要媒介。在固態(tài)發(fā)酵中,由于沒有游離水存在,所以基質(zhì)水活度αw必然會對微生物的生長和代謝能力產(chǎn)生重要影響。基質(zhì)水活度αw與含水量有關(guān)。發(fā)酵基質(zhì)中若含水量過大,則芽孢、晶體游離晚,發(fā)酵周期延長;含水量過低,菌體吸收不到培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)和水分,也會使發(fā)酵受抑制[18]。在發(fā)酵過程中,基質(zhì)水活度αw會隨著蒸發(fā)及微生物代謝活動的進行而逐漸降低,使得發(fā)酵難以正常進行。在大規(guī)模固態(tài)發(fā)酵過程中通常使用蒸發(fā)冷卻來進行溫度控制,也會造成較大的水分損失,使得固態(tài)培養(yǎng)基需要進行水分補充[19]。通過連續(xù)通濕空氣、安裝增濕器或隔一段時間往底物中添加無菌水的方法可以使αw維持在微生物生長所需要的最適值[20]。

2.2溫度

固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)多為有機質(zhì),導(dǎo)熱性能差,沒有自由流動的液相。隨著發(fā)酵的進行,發(fā)酵底物空隙率降低,使得發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝熱難以及時擴散開來,形成溫度梯度,甚至使得溫度急劇上升,大大高于菌種固態(tài)發(fā)酵的適宜溫度,從而影響固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵水平[21]。吳振強等[22]在對金龜子綠僵菌的固態(tài)發(fā)酵進行環(huán)境變量優(yōu)化研究時發(fā)現(xiàn)溫度可以對金龜子綠僵菌的菌絲生長和產(chǎn)孢量產(chǎn)生影響,當(dāng)溫度由適宜溫度升高到接近高限生長溫度時,將引起可逆性的生長率下降甚至抑制。采用熱電偶傳感器可以監(jiān)測物料的溫度和溫度變化梯度[20]。在實驗室規(guī)模反應(yīng)器中,可以將反應(yīng)器放置在溫度可控的環(huán)境中(例如水浴中)進行控溫[23]。在大規(guī)模固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)中,主要采用將通氣、溫度、濕度控制相耦合的方式作為主要的控溫措施。利用干燥的無菌空氣對固體培養(yǎng)基進行強制通風(fēng)可以加快熱量從固體培養(yǎng)基表面到氣相的傳遞速率,帶走大量的代謝熱量。同時為了防止固態(tài)培養(yǎng)基干燥,定期對培養(yǎng)基噴入無菌水,以維持固體培養(yǎng)基的含水量[8]。

2.3pH值

pH值是固態(tài)發(fā)酵過程中的關(guān)鍵因素。微生物發(fā)酵有其最適合和能夠耐受的pH值范圍。許多固態(tài)發(fā)酵過程的pH值具有特征性的變化,只是在固態(tài)發(fā)酵過程中缺乏在線測量濕潤物料pH值的有效方法,使得pH值難以控制。目前多采用的是在固態(tài)發(fā)酵時調(diào)節(jié)好培養(yǎng)基的初始pH值,選用具有較大緩沖能力的固態(tài)物料來進行發(fā)酵,發(fā)酵過程中通常不進行pH值的檢測和控制[24]。其他措施還有在培養(yǎng)基中添加緩沖液,用脲取代銨鹽作為主要的氮源來抵消發(fā)酵過程中生成的酸帶來的負(fù)面影響。陶玉貴[25]根據(jù)固體培養(yǎng)基難以調(diào)節(jié)pH值的特點,利用緩沖溶液對固體培養(yǎng)基用水進行pH值不同程度的調(diào)整,來研究培養(yǎng)基初始pH值對蘇云金芽孢桿菌毒力效價的影響,得到蘇云金芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵最適pH值為7.5。

2.4通氣與傳質(zhì)

通氣有助于氧氣從氣相傳遞到固態(tài)基質(zhì)表面上的微生物,同時也可以起到轉(zhuǎn)移代謝熱和二氧化碳的作用。通氣的速率和多少取決于微生物的特性、合成產(chǎn)物對氧的需求程度、發(fā)酵反應(yīng)產(chǎn)生的熱量多少、底物的料層厚度、微生物產(chǎn)生的二氧化碳和其它易揮發(fā)代謝產(chǎn)物的量和底物間的有效空隙。定時完全換氣或改變氣體流向是控制固態(tài)發(fā)酵中氣體的常用方法。通氣量過大會減少基質(zhì)的水分,降低基質(zhì)水活度,使得固態(tài)基質(zhì)需要進行水分補充。利用氣相色譜分析儀器分析發(fā)酵器頂部空間的氣體或用氧分析儀測定需氧量和吸收率可以對通氣量進行監(jiān)測,以便控制通氣量。

固態(tài)發(fā)酵的傳質(zhì)過程包括空氣進入和排出反應(yīng)器的過程;無通風(fēng)情況下空氣自然流動引起的自然對流、擴散過程;在生物反應(yīng)器壁和周圍環(huán)境之間發(fā)生的傳質(zhì)過程;攪拌過程中的剪切效果。一般情況下,可以利用下列措施改善傳質(zhì)狀況:以顆粒狀多孔或纖維狀物質(zhì)作為底物,減小底物厚度,增大底物間空隙,使用多孔淺盤發(fā)酵,攪拌底物或使用轉(zhuǎn)鼓反應(yīng)器。目前利用較多的方法是把強制通風(fēng)和攪拌相耦合起來[8]。

3固態(tài)發(fā)酵設(shè)備

固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器的研制對固態(tài)發(fā)酵的工業(yè)化推廣應(yīng)用具有重要意義。通過對固態(tài)發(fā)酵傳質(zhì)、傳熱和微生物生長數(shù)學(xué)模型的研究,近年來在規(guī)?；虘B(tài)發(fā)酵反應(yīng)器的研制上有著顯著的進展[26]。根據(jù)基質(zhì)的運動情況,固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器可以分為兩類:靜態(tài)固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器,在靜態(tài)體系中,整個發(fā)酵過程中固態(tài)基質(zhì)保持不動,包括淺盤式生物反應(yīng)器、填充床式生物反應(yīng)器等;動態(tài)固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器,體系中存在物料的混合過程,包括機械攪拌的筒、柱式反應(yīng)器、流化床式生物反應(yīng)器和轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器等。按照固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器規(guī)模的級別大小可以將其分為3種:實驗室規(guī)模固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器、中試固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器和工業(yè)級固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器。Durand[27]對各種級別的固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器進行了詳細(xì)的介紹。陳洪章等[28,29]研制出了一種工業(yè)級的氣相雙動態(tài)固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器,基本思想是對固態(tài)發(fā)酵罐內(nèi)的氣相壓力人為施以周期脈動,脈動的周期、振幅及波形將隨不同發(fā)酵對象、發(fā)酵時間而改變;其次,在氣相雙動態(tài)固態(tài)發(fā)酵罐內(nèi)設(shè)循環(huán)、風(fēng)道及多組冷卻排管,強制帶走物料中的熱量,并強制熱空氣與冷卻盤管熱量交換,降低發(fā)酵物料的溫度,并保證了發(fā)酵溫度與濕度的均勻一致與可調(diào)性。發(fā)酵過程中溫度、濕度、pH值可控,保證純種發(fā)酵,實現(xiàn)了規(guī)?；I(yè)生產(chǎn),設(shè)備投資和生產(chǎn)成本都遠(yuǎn)低于液體深層發(fā)酵。用蘇云金芽孢桿菌進行生產(chǎn)固態(tài)發(fā)酵,平均毒力效價16 000 IU/mg,最高批次達23 000 IU/mg。用白僵菌進行固態(tài)發(fā)酵,效價可比淺盤培養(yǎng)提高2～3倍。

4生物農(nóng)藥毒力檢測

毒力檢測是對生產(chǎn)出來的生物農(nóng)藥進行質(zhì)量檢驗的重要項目。通過毒力檢測可以檢驗發(fā)酵結(jié)果并指導(dǎo)發(fā)酵過程的改進和優(yōu)化。應(yīng)用于生物農(nóng)藥毒力檢測的主要方法有孢子計數(shù)法,生物測定法、高效液相色譜法、免疫分析法、質(zhì)譜分析法、電泳分析法等[30]。

生物測定法進行生物農(nóng)藥的毒力檢測是行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢測方法,普遍應(yīng)用于實驗和生產(chǎn)。其毒力檢測方法以敏感昆蟲為試蟲,同時檢驗供試樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品對蟲子的致死中濃度LC50值,并計算待測樣品的毒力效價,以此來估計供試樣品的毒效。方蘋等[31]使用小菜蛾測定固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)出的蘇云金芽孢桿菌的毒效,采用浸葉碟飼喂法檢測,用純水將試樣稀釋處理,然后將苞菜葉碟在藥液中浸漬10 s,取出自然晾干,分別飼喂3齡幼蟲,于72 h檢查幼蟲死活情況,計算死亡率。余子全等[32]建立了一套蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白對植物寄生線蟲的生物測定方法。生物測定法可以直觀的反應(yīng)菌株或制劑的毒力,但是需花費大量時間飼養(yǎng)昆蟲,而且操作程序復(fù)雜,易受被測試?yán)ハx的蟲齡、環(huán)境條件等因素影響。

倪鈺萍等[33]對SDS-PAGE毒素蛋白測定、生物測定、活芽孢計數(shù)3種測定蘇云金芽孢桿菌的方法進行了比較,通過對這3種方法適用范圍、定性定量分析、試驗周期、穩(wěn)定性、可重復(fù)性、允許相對偏差等因素的考察,綜合評價認(rèn)為采用SDS-PAGE毒素蛋白測定更為適宜。

5結(jié)論與展望

通過對文獻的分析可以看出,固態(tài)發(fā)酵在生物農(nóng)藥生產(chǎn)應(yīng)用領(lǐng)域的研究得到了巨大發(fā)展:發(fā)酵原料來源廣泛,既實現(xiàn)了生物農(nóng)藥的有效發(fā)酵,又對一些工農(nóng)業(yè)廢棄物實現(xiàn)了資源再利用;發(fā)酵條件和影響參數(shù)的控制研究逐步深入;工業(yè)化固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器大量出現(xiàn);毒力檢測方法多樣化。但是與液體深層發(fā)酵相比,目前固態(tài)發(fā)酵技術(shù)還缺乏全面的詳細(xì)研究,距工業(yè)化大規(guī)模的最優(yōu)化生產(chǎn)仍有很大距離。不過隨著固態(tài)發(fā)酵技術(shù)優(yōu)勢被越來越多的人認(rèn)識到,固態(tài)發(fā)酵研究必將得到更多地重視,得到更大地發(fā)展,從而推動生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的進步。

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