富士蘋果多酚氧化酶特性及褐變抑制研究

陳剛+馬曉+謝夢淑

摘要：研究了富士蘋果多酚氧化酶（PPO）的特性。結(jié)果表明，試驗最大吸收波長為400 nm，在4 ℃的條件下貯存的富士蘋果多酚氧化酶活性隨著時間的延長逐漸降低。富士蘋果多酚氧化酶的最適pH為6.5，最適溫度為35 ℃，在80 ℃以上失活。不同抑制劑對富士蘋果多酚氧化酶的抑制效果不同，抑制能力由高至低依次為抗壞血酸、檸檬酸、D-山梨醇、D-果糖、NaCl、EDTA-2Na。當(dāng)抗壞血酸的濃度為1 mmol/L時，富士蘋果多酚氧化酶的相對活性僅為5.10%。

關(guān)鍵詞：富士蘋果；多酚氧化酶（PPO）；特性；褐變抑制

中圖分類號：TS255 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）06-1107-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.029

Abstract： The polyphenol oxidase（PPO） properties of Fuji apple was studied. The result showed that the maximum absorbe wavelength was 400 nm. The PPO activity was weak as the solution with enzyme was stored at 4 ℃ after being extracted. The optimum pH of Fuji apple PPO was 6.5. The optimum temperature of Fuji apple PPO was 35 ℃ and lost its activity above 80 ℃. The effect of different inhibitors on the Fuji apple PPO was different. The order of the inhibitant capacity from high level to low level was ascorbic acid， citric acid， D-sorbitol， D-fructose，NaCl，EDTA-2Na. The relative activity of PPO was 5.10% when the ascobic acid concertration was 1 mmol/L.

Key words： Fuji apple； polyphenol oxidase（PPO）； properties； browning inhibition

富士蘋果屬于薔薇科蘋果屬。2004年中國總產(chǎn)量達(dá)2 000多萬t，接近世界總產(chǎn)量的50%[1]。蘋果容易在加工中褐變而影響蘋果的質(zhì)量，不僅影響感官質(zhì)量，而且影響風(fēng)味和營養(yǎng)價值。蘋果中的酚類化合物是蘋果發(fā)生褐變的重要原因，酶促褐變主要是由于多酚氧化酶（PPO）氧化內(nèi)源的酚類物質(zhì)生成醌。彼此相鄰的醌互相聚合，或者醌與蛋白質(zhì)、氨基酸等生成絡(luò)合物最終生成褐色素，并且色素分子的量越高，顏色越深。因此，對于蘋果多酚氧化酶的特性研究就顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料

以無病害、無機(jī)械傷、大小一致、成熟度一致、商品性良好的市售新鮮富士蘋果為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 富士蘋果PPO粗酶液的提取 將新鮮蘋果洗凈放入4 ℃冰箱中預(yù)冷2 h，取出去皮去核后，將蘋果切成碎塊，稱取果肉12 g，加入pH為5.0的檸檬酸-磷酸緩沖液30 mL及適量石英砂，冰浴研磨至勻漿，將勻漿移至離心管，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

1.2.2 富士蘋果PPO活性測定 將pH為6.0的檸檬酸-磷酸緩沖液2.0 mL與0.1 mol/L的鄰苯二酚溶液1.5 mL混勻，在35 ℃條件下保溫10 min，粗酶液以及熱失活的粗酶液分別在35 ℃條件下保溫10 min，在石英比色皿中迅速混勻，在400 nm下測定吸光度值，每隔15 s測定一次，共45 s，重復(fù)測定3次求平均值。以每毫升酶液在15 s內(nèi)吸光度改變0.001為一個酶活力單位。

1.2.3 最大吸收波長的確定 將pH為6.0的檸檬酸-磷酸緩沖液2.0 mL，0.1 mol/L的鄰苯二酚1.5 mL混勻，35 ℃保溫10 min，粗酶液以及熱失活的粗酶液分別在35 ℃保溫10 min；在石英比色皿中迅速將上述溶液混合，在390～420 nm之間以2 nm為間隔梯度進(jìn)行測量。

1.2.4 富士蘋果PPO酶液的保存 取新制酶液30 mL放入4 ℃冰箱中，每天同一時刻進(jìn)行酶活性測定，在反應(yīng)體系中依次加入在35 ℃保溫10 min的pH為6.5的檸檬酸-磷酸緩沖液2.0 mL與0.1 mol/L的鄰苯二酚溶液1.5 mL的混合液，以及在冰箱中保存并且35 ℃保溫10 min的0.2 mL酶液以相應(yīng)的新鮮酶液為對照。在400 nm的條件下按照上述方法連續(xù)6 d測定富士蘋果PPO活性。

1.2.5 pH對富士蘋果PPO活性的影響 在反應(yīng)體系中加入pH為3.0～8.5的以0.5為梯度的檸檬酸-磷酸緩沖液2 mL，0.1 mol/L的鄰苯二酚溶液1.5 mL、0.2 mL酶液。在最適波長400 nm條件下按照上述方法測定富士蘋果PPO的活性。

1.2.6 溫度對富士蘋果PPO活性的影響 在比色皿中，加入35 ℃保溫10 min的pH為6.5的檸檬酸-磷酸緩沖液2 mL與0.1 mol/L的鄰苯二酚1.5 mL混合液，以及相應(yīng)溫度下（0～75 ℃，以5 ℃為梯度）保溫的酶液。在400 nm條件下按照上述方法測定富士蘋果PPO的活性。

1.2.7 底物濃度對富士蘋果PPO活性的影響 在比色皿中依次加入在35 ℃保溫10 min的pH為6.5的檸檬酸-磷酸緩沖液2 mL及以0.025 mol/L為梯度的0.025～0.250 mol/L的鄰苯二酚1.5 mL混合均勻，以及35 ℃保溫10 min的新鮮酶液0.2 mL。在400 nm條件下按照上述方法測定富士蘋果PPO的活性。

1.2.8 抑制劑對富士蘋果PPO活性的影響 在比色皿中依次加入在35 ℃保溫10 min的pH為6.5的檸檬酸-磷酸緩沖液2.0 mL、0.1 mol/L的鄰苯二酚1.5 mL、相應(yīng)濃度的抑制劑0.1 mL的混合液，以及保溫10 min的0.2 mL新制酶液。抑制劑種類及濃度如下：0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50、1.00 mol/L的檸檬酸、NaCl、D-山梨醇、D-果糖，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L的EDTA-2Na，0.5、1.0、1.5 mmol/L的抗壞血酸。在400 nm條件下按照上述方法測定富士蘋果PPO的活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPO反應(yīng)液的最大吸收波長

由圖1可知，PPO反應(yīng)液在不同波長條件下的吸收情況呈現(xiàn)單峰曲線。波長為390～400 nm條件下，PPO活性呈現(xiàn)上升趨勢；波長為400 nm時，吸收值最大；在400～420 nm條件下，PPO活性呈現(xiàn)下降趨勢；在420 nm條件下的PPO活性為400 nm條件下的56.5%。因此，本試驗以最大吸收波長400 nm作為工作波長。而付聿成等[2]研究認(rèn)為金帥蘋果PPO酶促反應(yīng)產(chǎn)物在412 nm下有最大吸收峰，可能與試驗材料不同有關(guān)。

2.2 酶液的保存

由圖2可知，酶的活性隨著保存時間的延長呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。第1天時活力明顯下降，為試驗開始時酶活性的71.1%；第2天酶的活性下降的幅度較小，酶的活性變化不大，為第0天的59.8%；隨后酶的活性逐步降低，當(dāng)保存6 d時，活力僅為第0天的52.9%。

2.3 pH對富士蘋果PPO活性的影響

富士蘋果中的PPO對pH的變化十分敏感。由圖3可知，當(dāng)pH在3.0～6.5時，PPO的活性呈現(xiàn)上升趨勢；當(dāng)pH為6.5時，表現(xiàn)為最高活性（酶活性100%）；當(dāng)pH在6.5～8.5時，酶活性呈現(xiàn)下降的趨勢；當(dāng)pH為3時，其活性只有最高活性的12%；當(dāng)pH上升到8.5時，其活性只有最高活性的9%。這主要是因為蘋果多酚氧化酶是一種含銅蛋白。當(dāng)pH相對較低時，一方面蛋白質(zhì)變性，酶失活，另一方面，銅從酶中解離出來，使酶失活[3]；當(dāng)pH相對較高時，酶蛋白與銅在堿性條件下發(fā)生脫離，生成不溶性的Cu（OH）2沉淀，也可以使酶失活。因此加工過程中可以調(diào)整pH減少褐變的發(fā)生。

付聿成等[2]研究認(rèn)為金帥蘋果PPO的最適pH為5.0，在pH為5.0～6.8范圍內(nèi)有較高的穩(wěn)定性，王瓊波等[4]認(rèn)為嘎拉蘋果PPO的最適pH為6.0，田蘭蘭等[5]研究得出富士蘋果PPO的最適pH為5.0，劉樹興等[6]的試驗結(jié)果表明，脫水蘋果片多酚氧化酶的最適pH為6.0，而粉紅女士蘋果PPO最適pH為4.5[7]，劉文山等[8]用冷凍丙酮制備蘋果PPO氧化鄰苯二酚的最適pH為6.0。以上研究結(jié)果可知，不同品種蘋果PPO的最適pH不同。

2.4 溫度對富士蘋果PPO活性的影響

由圖4可知，當(dāng)溫度在10 ℃以下時PPO活性較低。當(dāng)溫度在0 ℃時，酶活性僅有最高活性的3.3%；當(dāng)溫度在10～35 ℃時，酶活性呈現(xiàn)上升的趨勢，在35 ℃達(dá)到最高值（酶活性100%）；在35～80 ℃的溫度范圍時，PPO活性呈下降趨勢；當(dāng)溫度上升到75 ℃時，酶活性僅有最高活性的9.2%；當(dāng)溫度上升至80 ℃時，3 min以后多酚氧化酶失活。

不同蘋果部位的PPO最適溫度不同，酶失活所需的溫度與時間也不同。付聿成等[2]研究認(rèn)為金帥蘋果PPO的最適溫度為40 ℃。嘎拉蘋果PPO最適反應(yīng)溫度是45 ℃[4]。富士蘋果PPO最適溫度30 ℃[5]。王瓊波等[4]認(rèn)為嘎拉蘋果PPO在80、90、100 ℃分別處理280、240、200 s時完全失活，脫水蘋果片多酚氧化酶最適溫度為36 ℃，100 ℃熱燙60 s可使其完全失活[6]。粉紅女士蘋果PPO最適溫度為30 ℃，溫度為90 ℃，處理3 min后粉紅女士蘋果PPO活性下降為原來的10.13%，酶活性基本被抑制[7]。冷凍丙酮制備蘋果多酚氧化酶最適溫度為25 ℃；PPO在20～25 ℃時對熱較穩(wěn)定，其后隨著溫度的升高酶活迅速降低；在100 ℃維持1 min酶全部失活[8]。

2.5 鄰苯二酚的濃度對富士蘋果PPO活性的影響

由圖5可知，在酶濃度不變的情況下，當(dāng)?shù)孜餄舛认鄬^低時，相對活性隨著底物濃度的增大而加快；而后隨底物濃度的增大，相對活性的增加量逐漸縮減；最后相對活性達(dá)到最大值，相對活性不再隨底物濃度的變化而變化。當(dāng)鄰苯二酚的濃度增加到0.125 mol/L之后，增加底物濃度，吸光度不再變化達(dá)到最大值。在底物濃度達(dá)到0.25 mol/L時酶活力仍保持一定的反應(yīng)速度，并沒有隨底物濃度的增加而對酶活力產(chǎn)生抑制作用。田蘭蘭等[5]研究認(rèn)為富士蘋果PPO對4種底物催化活性不同，由高到低的順序依次為鄰苯二酚、DL-半胱氨酸、苯甲酸、山梨酸；富士蘋果PPO最佳底物濃度為0.6 mol/L。宋蓮軍[7]研究粉紅女士蘋果PPO的特性時也以鄰苯二酚為底物。

2.6 抑制劑對富士蘋果PPO活性的影響

由圖6可知，蘋果PPO活性抑制劑的抑制作用隨抑制劑濃度的增大而增強(qiáng)。6種抑制劑對PPO活力的抑制效果大體上依次為抗壞血酸、EDTA-2Na、檸檬酸、D-山梨醇、D-果糖、NaCl?？箟难嵊凶蠲黠@的抑制作用，隨著濃度的增加，PPO相對活性降低。當(dāng)抗壞血酸濃度為1 mmol/L時，PPO相對活性僅為5.1%；當(dāng)其濃度繼續(xù)增大至1.5 mmol/L時，PPO的相對活性降為0?？赡芸箟难崾且环N維生素，它可將酶促反應(yīng)的中間產(chǎn)物醌還原，從而抑制了褐變。由此可以看出，抗壞血酸對PPO的活性既有較好的抑制作用，同時又是食品中應(yīng)有的營養(yǎng)成分，是生產(chǎn)中防止食品發(fā)生褐變的理想抑制劑。

不同抑制劑對蘋果PPO活性的研究也較多。王瓊波等[4]研究表明NaCl和蔗糖對嘎拉蘋果PPO活性沒有影響，抗壞血酸、檸檬酸、檸檬汁和橘子汁對嘎拉蘋果PPO有很好的抑制作用，維生素C、檸檬酸、橘子汁以及維生素C和檸檬酸的交互作用對PPO的抑制作用極顯著，它們對PPO的抑制順序是維生素C>檸檬酸>維生素C×檸檬酸>橘子汁。田蘭蘭等[5]發(fā)現(xiàn)當(dāng)維生素C濃度達(dá)到150 mmol/L時，90%的富士蘋果PPO酶活性被抑制。Jang等[9]認(rèn)為抗壞血酸處理可顯著抑制鮮切蘋果果肉褐變率及PPO的活性，抑制率分別高達(dá)46%和98%。也有研究顯示，抗壞血酸和黃酮類物質(zhì)能明顯地抑制冷凍丙酮制備蘋果多酚氧化酶酶促褐變[8]。吳士云等[10]的研究也發(fā)現(xiàn)蘋果片多酚氧化酶酶活力在1.0%～1.5%的抗壞血酸溶液中顯著降低。Jang等[11]發(fā)現(xiàn)超聲波與VC聯(lián)合處理可以鈍化貯藏中蘋果的多酚氧化酶活性。上述研究結(jié)果均提示抗壞血酸在蘋果酶促褐變中的強(qiáng)抑制作用，將抗壞血酸與其他技術(shù)相結(jié)合也能起到降低蘋果多酚氧化酶活性的作用。本研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸也能較好地抑制蘋果多酚氧化酶的活性，而且檸檬酸是植物中的天然成分，實際應(yīng)用較安全，不失為一個新選擇。

3 結(jié)論

當(dāng)波長為400 nm時，多酚氧化酶活性測定體系的吸光度值最大。酶的活性隨著存放時間的延長逐漸降低，新鮮粗酶液最多可在4 ℃條件下保存3 d。多酚氧化酶最適pH為6.5，并且在此條件下活性比較穩(wěn)定。當(dāng)pH在5.5～7.0時，酶活性較高；其他pH下的酶活性均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，因此可以通過調(diào)整產(chǎn)品的pH控制褐變程度。多酚氧化酶對熱很敏感，其最適宜的溫度為35 ℃，80 ℃條件下處理3 min，多酚氧化酶完全失活。鄰苯二酚的濃度增加到0.125 mol/L之后，增加底物濃度，吸光度不再變化。在底物濃度達(dá)到0.25 mol/L時酶活力仍保持一定的反應(yīng)速度，并沒有隨底物濃度的增加而對酶活力產(chǎn)生抑制作用。抑制劑對蘋果多酚氧化酶的活性均有一定的抑制能力，且抑制劑濃度越大抑制能力越強(qiáng)，實際生產(chǎn)中可采用抗壞血酸或檸檬酸作為富士蘋果制品褐變的有效抑制劑。

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