根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的白菜類作物轉(zhuǎn)化體系研究進(jìn)展

摘要：白菜類作物是我國乃至世界性的大眾蔬菜，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)將目的基因轉(zhuǎn)入蔬菜中，從而選育具有特殊性狀的新品種。文章綜述了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的白菜類作物高頻再生轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建的影響因素，簡要介紹了轉(zhuǎn)化植株的分子檢測及遺傳行為，在此基礎(chǔ)上分析了目前遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在白菜類作物改良上存在的問題及廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：白菜類作物；根癌農(nóng)桿菌；轉(zhuǎn)基因；分子檢測；遺傳轉(zhuǎn)化

白菜類作物屬于十字花科(Crociferae)蕓薹屬蕓薹種(Brosslca campestris L.)中的栽培變種群。原產(chǎn)我國，目前廣泛種植于中國、日本、韓國、朝鮮等東亞及東南亞國家。大白菜(Brassica ssp.pekinensis)、小白菜(Brassica ssp.chinensis)、白菜型油菜(Brassica ssp.oleifera)均屬于該種。隨著組織培養(yǎng)和DNA重組技術(shù)的建立和不斷完善，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成為改良農(nóng)藝性狀。解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)難題的重要手段。由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成本低、簡便易行、轉(zhuǎn)化效率較高，因此成為白菜類作物遺傳轉(zhuǎn)化中最常用的方法。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)、油菜、芥菜、蕪菁等蕓薹屬植物的遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)獲得了很大的成功。但白菜類作物的遺傳轉(zhuǎn)化僅在近年才有報(bào)道，其中主要集中在大白菜的遺傳轉(zhuǎn)化上，有關(guān)白菜和菜心的遺傳轉(zhuǎn)化成功的報(bào)道很少。究其原因是由于白菜具有AA基因組，與蕓薹屬的其他具有BB和CC基因組的植物相比，其不定芽和植株再生比較難，此外，不同的抑菌劑和轉(zhuǎn)化菌株對外植體的分化也有一定的影響。因此，研究白菜類蔬菜的遺傳轉(zhuǎn)化體系，對基因工程技術(shù)在白菜類作物遺傳育種領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用具有重要的理論和實(shí)踐意義。筆者就高頻再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系這兩方面進(jìn)行概述。

1 高頻再生體系的建立

建立高頻再生體系是植物遺傳轉(zhuǎn)化的前提。組織培養(yǎng)包括原生質(zhì)體培養(yǎng)再生體系已在蕓薹屬的很多種中建立。相比之下，白菜類作物轉(zhuǎn)化難度較大。近年來，研究人員通過調(diào)整培養(yǎng)基中激素的種類和濃度，添加一定濃度的AgNO₃，改變瓊脂濃度條件等，已相繼建立了離體植株再生體系。

1.1 植物基因型

不同基因型的植株離體再生能力的差異較大。Zhang等對123個(gè)大白菜品種進(jìn)行對比試驗(yàn)，有115個(gè)品種產(chǎn)生了不定芽，再生頻率從0到95％不等。他認(rèn)為植株再生能力與品種的起源、成熟期的長短無關(guān)，與體細(xì)胞器官發(fā)生能力及小孢子胚胎發(fā)生能力無關(guān)，而只與其基因型有關(guān)。曹家樹研究了上海青、矮抗青、杭州油冬兒等8個(gè)品種，發(fā)現(xiàn)青梗類白菜品種的植株再生頻率明顯高于白梗類品種，認(rèn)為青梗類品種更適宜于離體培養(yǎng)的植株再生。因此，選擇合適的基因型對試驗(yàn)成功起著至關(guān)重要的作用。

1.2 外植體

用于轉(zhuǎn)化的外植體組織通常有下胚軸、子葉柄、子葉、莖段等，較常用的為下胚軸、子葉、子葉柄。不同外植體組織的再生頻率不同，王凌健等以青菜子葉和下胚軸為外植體誘導(dǎo)分化，子葉的分化頻率達(dá)56.3％，而下胚軸為37％左右。杜虹等以大白菜的子葉和下胚軸為外植體誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)以子葉為外植體誘導(dǎo)再生芽比下胚軸要好。

1.3 植物激素

組織培養(yǎng)中激素的配比決定了外植體在培養(yǎng)基上生長的形態(tài)。一般來說，生長素與細(xì)胞分裂素的比值低，易誘導(dǎo)芽的發(fā)生：相反則易誘導(dǎo)根的發(fā)生；比值處于中間，容易產(chǎn)生愈傷組織，多年來，學(xué)者們都摸索出了適合自己試驗(yàn)條件的激素濃度。激素以BA、NAA組合為多，也有用BAP、NAA組合的。白菜類作物BA(BAP)的使用濃度一般為2～5 mg/L，NAA一般為0.5～1mg/L。

1.4 AgNO₃對再生體系的影響

組織培養(yǎng)過程中，加入AgNO₃可明顯提高轉(zhuǎn)化效率。培養(yǎng)基中添加AgNO₃后，Ag+競爭性結(jié)合位于細(xì)胞間膜的乙烯受體部位而抑制乙烯活性，并且干擾乙烯信號傳遞途徑，從而促進(jìn)器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生。杜虹等的研究表明，大白菜的芽再生率從未添加AgNO₃的28.2％，添加1.2×10^-5mol/L后提高到71.7％。也有的學(xué)者認(rèn)為AgNO₃與ABA配合使用更能促進(jìn)白菜不定芽的發(fā)生，王火旭認(rèn)為AgNO₃與ABA具有協(xié)同增效作用。其中AgNO₃是關(guān)鍵因子，ABA有促進(jìn)作用，能改善不定芽的質(zhì)量，減少玻璃芽的產(chǎn)生。但對某些基因型品種，添加AgNO₃，并沒有使其誘導(dǎo)出不定芽，而且隨著AgNO₃含量的提高，芽分化率有所降低，這可能是由于Ag+與培養(yǎng)基中的陰離子發(fā)生反應(yīng)，打破了離子平衡，改變了培養(yǎng)基的pH值。而且Ag+離子是重金屬，對植物體有毒害作用，因此培養(yǎng)基中AgNO₃的含量不能過高。

1.5 瓊脂濃度對再生體系的影響

Zhang等用不同濃度的瓊脂培養(yǎng)基處理外植體，發(fā)現(xiàn)1.2％或1.6％的瓊脂培養(yǎng)基比0.8％的培養(yǎng)基芽再生率高2～3倍。他還發(fā)現(xiàn)隨著瓊脂濃度的升高，培養(yǎng)基中的乙烯含量逐漸降低。這可能是高濃度的瓊脂改變了培養(yǎng)基中水分的存在狀態(tài)，同時(shí)培養(yǎng)基中濕度下降，改變了外植體再生的小氣候而使其再生頻率提高。

2 遺傳轉(zhuǎn)化與植株再生

農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)是迄今植物基因工程中應(yīng)用最多、最理想、也是最簡單的方法，已獲得的轉(zhuǎn)基因植物中80％來自農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌有2種：根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌。在白菜研究中，多數(shù)學(xué)者采用根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

2.1 不依賴于植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

曹鳴慶等采用原位滲入轉(zhuǎn)化方法應(yīng)用于49菜心，獲得了遺傳上穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株，使得小白菜成為第1例成功應(yīng)用該技術(shù)的有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物，但這一方法在操作過程中有很多缺陷，應(yīng)用起來有較大難度。戴大鵬在此基礎(chǔ)上選用小白菜花序切口及花序進(jìn)行轉(zhuǎn)化，簡化了操作過程并成功將目的基因整合入植株中，為白菜類作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展提供了新的技術(shù)途徑，但該方法的轉(zhuǎn)化效率較低，有待進(jìn)一步的研究。

2.2 建立在細(xì)胞或組織培養(yǎng)基礎(chǔ)上的遺傳轉(zhuǎn)化

依賴細(xì)胞(或組織培養(yǎng))的遺傳轉(zhuǎn)化是由植物細(xì)胞和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時(shí)間，轉(zhuǎn)化體在古適宜濃度的抗生素、抑菌劑的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)生了T-DNA轉(zhuǎn)移的復(fù)雜生物學(xué)過程。影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的因素很多，主要有以下幾方面：

2.2.1 農(nóng)桿菌菌株對轉(zhuǎn)化和再生的影響農(nóng)桿菌依其產(chǎn)生的冠癭堿不同，可分為章魚堿型(octopine)、胭脂堿型(nopaline)、農(nóng)桿堿型(agropine)和琥珀型(succinamopine)。Kuvshinov等用3個(gè)不同的菌株(C58C1，EHA105，LB4404)侵染白菜型油菜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LBA4404的轉(zhuǎn)化效率較好，大約是C58C1、EHA105轉(zhuǎn)化效率的2倍，余小林等用EHA105和LBA4404感染白菜和菜心的子葉柄一子葉外植體，采用統(tǒng)計(jì)分析方法對產(chǎn)生的不定芽進(jìn)行結(jié)果分析得到白菜類作物遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，LBA4404感染效果較好；而范正琪用EHA105和LBA4404侵染青菜，結(jié)果顯示EHA105轉(zhuǎn)化時(shí)，gus瞬時(shí)表達(dá)頻率(52％)高于LBA4404(47.1％)。試驗(yàn)結(jié)論的一致可能與供試材料基因型有關(guān)。

2.2.2 Vir基因 由于根癌農(nóng)桿菌的感染能力主要受Ti質(zhì)粒的Vir基因調(diào)節(jié)，因此，如何誘導(dǎo)Vir基因的高效表達(dá)一直是學(xué)者們研究的重點(diǎn)m問。Vemader等認(rèn)為在酸性條件和加入酚類物質(zhì)(如乙酰丁香酮)的條件下，Vir的活性得到提高。白菜類作物乙酰丁香酮(As)的使用濃度為20-200 umol/L，但濃度與轉(zhuǎn)化效率的關(guān)系目前尚未見報(bào)道。介導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程中，As的使用有3種情況：(1)在農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)時(shí)加入As；(2)在農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)時(shí)加入As；(3)在農(nóng)桿菌培養(yǎng)及共培養(yǎng)時(shí)均加入As，誘導(dǎo)活化Vir基因。

張鳳蘭在共培養(yǎng)基中加入As，pH值5.2條件下通過對3個(gè)大白菜品種進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，得到降低共培養(yǎng)基的pH值，加入As可以提高根癌農(nóng)桿菌感染白菜外植體的頻率。而楊廣東等在共培養(yǎng)基中加入As對4個(gè)大白菜品種進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染時(shí)，發(fā)現(xiàn)As對轉(zhuǎn)化頻率有一定的促進(jìn)作用，但差異并不顯著；相反在侵染前附加時(shí)轉(zhuǎn)化頻率反而降低，原因可能是與品種基因型有關(guān)。

決定農(nóng)桿菌Vir基因誘導(dǎo)的關(guān)鍵時(shí)期為共培養(yǎng)時(shí)段，注意共培養(yǎng)時(shí)的幾個(gè)關(guān)鍵則可以使Vir基因得以高效表達(dá)，進(jìn)而為后期的轉(zhuǎn)化打下好的基礎(chǔ)：(1)避免農(nóng)桿菌在酵母提取物存在的環(huán)境下過度生長，通常把農(nóng)桿菌培養(yǎng)液離心，用MS液體培養(yǎng)基重懸農(nóng)桿菌沉淀；(2)共培養(yǎng)基中要含有較高的糖濃度，蔗糖含量應(yīng)在30％以上。也可同時(shí)在培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖或椰子汁；(3)培養(yǎng)基pH值介于5.0～5.6；(4)共培養(yǎng)時(shí)的溫度低于28℃，一般置25℃暗處共培養(yǎng)；(5)共培養(yǎng)時(shí)間通常以2～3d為好，目前只有范正琪通過對青菜帶柄子葉進(jìn)行轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)5 d轉(zhuǎn)化的頻率較高。

2.2.3 植物基因型及外植體種類 植物基因型對遺傳轉(zhuǎn)化的影響在擬南芥等模式植物上均有報(bào)道，同樣基因型對白菜類作物的遺傳轉(zhuǎn)化也存在影響。范正琪選取5個(gè)青菜品種進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，得到高樺白菜轉(zhuǎn)化頻率最高。Muknopadhyay，Takasaki及Lim等分別從白菜型油菜、擬南芥及大白菜的下胚軸得到轉(zhuǎn)化體。Jun，張鳳蘭和余小林等以子葉－子葉柄為轉(zhuǎn)化受體，在大白菜上得到了轉(zhuǎn)化體。劉凡等以小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生的胚為轉(zhuǎn)化受體，在大白菜上得到了轉(zhuǎn)化株，為再生難的白菜類基因型轉(zhuǎn)化提供了一條新途徑。

2.2.4 抗生素 在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過程中，為了抑制農(nóng)桿菌的生長，需要在共培養(yǎng)以后加入抗生素。抗生素抑菌的好壞直接影響轉(zhuǎn)化效率。白菜類作物常用的抗生素有氨芐青霉素(Amoicillin)、羧芐青霉索(Carbenillln)、頭孢霉素(Cefo－taxime)、淡紫青霉素(LilaciHin)等。在有效抑菌濃度范圍內(nèi)氨芐青霉素質(zhì)量濃度在500mg/L以下，對不定芽的再生有輕微的抑制作用。而羧芐青霉素則有促進(jìn)作用(250～500 mg/L)，頭孢霉素對不定芽的再生有明顯的抑制作用，易引起外植體傷口褐化死亡，這也許與白菜類蔬菜對頭孢霉素過于敏感有關(guān)。張鳳蘭認(rèn)為淡紫青霉素較好，他通過研究不同濃度的淡紫青霉素對白菜子葉不定芽的影響，發(fā)現(xiàn)不定芽再生幾乎不受淡紫青霉素的影響。由于淡紫青霉素在國內(nèi)較難買到，關(guān)于它的應(yīng)用報(bào)道較少，因而羧芐青霉素暫時(shí)是首選的抗生素。

2.2.5 篩選劑對轉(zhuǎn)化的影響 共培養(yǎng)后，組織中存在著轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，而前者所占的比例較低，須施加選擇壓，才能促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的分裂和生長，抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，進(jìn)而選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因植株。白菜類作物中使用的篩選標(biāo)記有：卡那霉素抗性和潮霉素抗性。選擇標(biāo)記的種類、選擇濃度及選擇時(shí)間是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素。Takasaki等用卡那霉素選擇小白菜轉(zhuǎn)化株，得到了大量的逃逸體。而用低濃度的潮霉素沒有逃逸體。然而用卡那霉素選擇的轉(zhuǎn)化頻率比用潮霉素要高，可能是因?yàn)槌泵顾剡x擇壓力大，對一些外源基因表達(dá)水平低的芽也產(chǎn)生了抑制生長作用。KuvshinovIml和范正琪分別在白菜類油菜和青菜中得到了類似的結(jié)論?？敲顾爻Ｓ觅|(zhì)量濃度以5～10mg/L好，潮霉素質(zhì)量濃度要低于5mg/L。

總的說來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)白菜類作物遺傳轉(zhuǎn)化過程可劃分為預(yù)培養(yǎng)→共培養(yǎng)→恢復(fù)培養(yǎng)→篩選分化培養(yǎng)→生根培養(yǎng)階段。以下胚軸為外植體時(shí)進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)多可以提高植株的再生頻率，預(yù)培養(yǎng)2～3d為宜，采用其他外植體類型時(shí)，預(yù)培養(yǎng)過程往往對轉(zhuǎn)化率的提高作用不大，張鳳蘭通過以子葉一子葉柄為外植體進(jìn)行白菜的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)可以在根癌農(nóng)桿菌感染前不用預(yù)培養(yǎng)：根癌農(nóng)桿菌侵染時(shí)菌液濃度、侵染時(shí)間及培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化有很重要的影響：張鳳蘭對大白菜進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)用OD₆₀₀ 0.8的菌液侵染外植體10～15min，共培養(yǎng)3 d；王火旭用菌液OD₆₀₀ 0.3～0.5，浸染大白菜2～10min，共培養(yǎng)2～3 d；范正琪用菌液OD₆₀₀ 0.5左右侵染青菜帶柄子葉15min，共培養(yǎng)5 d。上述試驗(yàn)均獲得了轉(zhuǎn)化苗，但條件卻不能普遍應(yīng)用。此外有些學(xué)者認(rèn)為在共培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮(As)可以提高轉(zhuǎn)化效率，而有些研究者發(fā)現(xiàn)加入As對轉(zhuǎn)化效率的影響不大。藍(lán)海燕則認(rèn)為加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可以克服組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象。外植體共培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基前進(jìn)行恢復(fù)是必要的，但恢復(fù)期越長，產(chǎn)生的逃逸體就會(huì)越多。由于白菜類作物比較脆弱，選擇壓的濃度應(yīng)以溫和為好，從而易獲得轉(zhuǎn)化苗。進(jìn)行篩選分化時(shí)，要注意乙烯對芽分化的影響：適宜的AgNO₃濃度可以解除乙烯對芽分化的影響。Mu-knopadhyay在白菜型油菜的轉(zhuǎn)化中，發(fā)現(xiàn)較高的AgNO₃濃度(70-90 nmol)是在選擇條件下獲得轉(zhuǎn)化體的必要條件。然而Kuvshinov認(rèn)為，過高的AgNO₃質(zhì)量濃度(超過15mg/L，約90nmol)不利于轉(zhuǎn)化，以5mg/L為好；張風(fēng)蘭在大白菜的轉(zhuǎn)化中，發(fā)現(xiàn)較高的瓊脂濃度(1.6％)有利于大白菜不定芽分化和根的生成。

3 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測及轉(zhuǎn)化基因的遺傳分析

證明外源基因在植物染色體上整合最可靠的方法是分子雜交：DNA水平上可以通過PCR及Southern雜交來確定外源基因的導(dǎo)人及整合；RNA水平上可以通過Northern雜交及RT-PCR檢測外源基因是否轉(zhuǎn)錄：蛋白質(zhì)水平上可以通過Western雜交測定外源基因的表達(dá)。Kuvshinov采用組織一葡萄糖醛酸酶染色和Southern雜交進(jìn)行檢測，結(jié)果獲得的轉(zhuǎn)化株僅為4％～9％。這種行為的發(fā)生是因?yàn)檗r(nóng)桿菌介導(dǎo)的白菜類作物轉(zhuǎn)基因植株中，多數(shù)為單拷貝植株，它們的遺傳傳遞行為符合孟德爾的遺傳規(guī)律：單拷貝轉(zhuǎn)基因植株自交后代的遺傳分離比一般為3:1，而有時(shí)又因插入的T-DNA出現(xiàn)甲基化等遺傳變異而失活，導(dǎo)致后代中并非所有插入的T-DNA都能得以表達(dá)。

4 存在的問題和展望

多年來學(xué)者們通過努力成功摸索出了白菜類作物不同基因型品種的遺傳轉(zhuǎn)化體系，但仍存在著很多的問題：(1)摸索出來的各項(xiàng)參數(shù)還未達(dá)到優(yōu)化，成功的例子差異較大，有些參數(shù)的條件不能普遍應(yīng)用；(2)雖然現(xiàn)在有些學(xué)者找到了耨的技術(shù)，彌補(bǔ)了以前試驗(yàn)中的一些不足。但轉(zhuǎn)化的效率較低，還需要進(jìn)一步深入的研究；(3)獲得的轉(zhuǎn)基因植株所占比例過小，與之相對的試驗(yàn)所需人力費(fèi)用卻較大，需要研制出更經(jīng)濟(jì)的轉(zhuǎn)化體系；(4)轉(zhuǎn)化植株后代遺傳穩(wěn)定性的問題還沒有得到真正的解決；(5)轉(zhuǎn)基因白菜的食品安全性問題沒有得到更好的解決。因此白菜類作物的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系亟待完善。只有研究者們不斷努力，加強(qiáng)合作，才能使基因工程技術(shù)在白菜類蔬菜作物生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。更好地為人們服務(wù)。