指紋圖譜技術(shù)在植物研究領(lǐng)域中的應(yīng)用

摘要：文章對(duì)指紋圖譜的產(chǎn)生及其概念進(jìn)行了介紹，綜述了國(guó)內(nèi)外有關(guān)指紋圖譜研究的進(jìn)展。論述了指紋圖譜的作用、構(gòu)建程序以及指紋圖譜研究過(guò)程中存在的問(wèn)題。重點(diǎn)探討了現(xiàn)代分析技術(shù)在指紋圖譜研究中的應(yīng)用，最后，對(duì)指紋圖譜技術(shù)的研究前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：指紋圖譜；藥用植物；研究；應(yīng)用

隨著中國(guó)加入WTO，藥用植物產(chǎn)品如何被世界所認(rèn)同和接受，已經(jīng)成為中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)面臨的重要課題。實(shí)踐證明系統(tǒng)分析藥用植物的化學(xué)成分，闡明有效部位和活性成分的種類是可行的，建立全面反映所含活性成分的指紋圖譜，將更加有效地體現(xiàn)藥用植物活性成分的整體性和綜合作用，從而更好地評(píng)價(jià)藥用植物的質(zhì)量。

一、指紋圖譜的產(chǎn)生與研究進(jìn)展

（一）指紋圖譜的概念

指紋圖譜是經(jīng)色譜或光譜測(cè)定得到的組分群體的圖譜或圖像。中藥指紋圖譜是指某種（或某產(chǎn)地）中藥材或中成藥進(jìn)行適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段得到的、能夠標(biāo)示該中藥材或中成藥特性的某類或數(shù)類成分的色譜或光譜的圖譜，它具有特征性和穩(wěn)定性。指紋圖譜能全面、綜合地反應(yīng)和控制中藥或天然藥物質(zhì)量。

（二）國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展

植物藥指紋圖譜的研究始于20世紀(jì)70年代，但主要限于學(xué)術(shù)界。德國(guó)和法國(guó)聯(lián)合開發(fā)銀杏葉提取物Egb761，找到了最佳銀杏提取物的指紋圖譜，導(dǎo)致植物藥在歐美重新流行。日本漢方藥主要生產(chǎn)企業(yè)在20世紀(jì)80年代末就已普遍采用色譜方法來(lái)監(jiān)控其產(chǎn)品質(zhì)量。韓國(guó)、日本、德國(guó)等，都比較重視對(duì)植物藥的開發(fā)和利用。中藥指紋圖譜技術(shù)是隨現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展而誕生的。中國(guó)中藥指紋圖譜研究最早可以追溯到20世紀(jì)60年代，但由于當(dāng)時(shí)的主客觀條件限制和時(shí)機(jī)不夠成熟，這些探索沒(méi)能繼續(xù)下去。后來(lái)不斷有人研究，但主要限于學(xué)術(shù)研究的層面，在傳統(tǒng)的中藥質(zhì)量控制模式中，沒(méi)有指紋圖譜的要求，所以對(duì)中國(guó)中藥產(chǎn)業(yè)沒(méi)有任何觸動(dòng)。

近年來(lái)，隨著中藥現(xiàn)代化、國(guó)際化的深入發(fā)展，政府、企業(yè)和研究人員越來(lái)越清醒地認(rèn)識(shí)到控制中藥的質(zhì)量是亟待解決的關(guān)鍵技術(shù)之一。中國(guó)中醫(yī)研究院中藥所的指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化研究，對(duì)一批中藥材進(jìn)行檢查、鑒別、含量測(cè)定等指紋圖譜方面的基礎(chǔ)性研究，從而建立起一套完整的對(duì)中藥材質(zhì)量全面綜合的評(píng)估系統(tǒng)。中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門也于2000年發(fā)布了《中藥注射劑的指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》，明確要求對(duì)新申報(bào)的中藥注射劑和已上市的中藥注射劑實(shí)行指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)。2003年，國(guó)家采用中藥指紋圖譜檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)后第一個(gè)批準(zhǔn)上市的中藥注射劑已正式投產(chǎn)。中國(guó)在中藥指紋圖譜取得的成績(jī)得到了國(guó)際同行的肯定，WHO也因此委托國(guó)家藥品監(jiān)督管理局起草《國(guó)際草藥標(biāo)準(zhǔn)》。

二、指紋圖譜的作用及其構(gòu)建

（一）指紋圖譜的作用

指紋圖譜在評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量中的作用主要可以概括為觀察指紋圖譜的整體特征以鑒別生產(chǎn)前藥材的真?zhèn)危恢讣y圖譜可以區(qū)分植物藥材的不同部位；可以考察商品藥材及成藥的質(zhì)量；從標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜可追蹤制劑中某些化學(xué)成分的變化；可以檢測(cè)原料與成品之間，成品的批間質(zhì)量的穩(wěn)定性。中藥指紋圖譜是從宏觀上整體把握中藥質(zhì)量，而不是分析單一的、少量的成分。使評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量更加科學(xué)化、標(biāo)準(zhǔn)化。通過(guò)指紋圖譜可以鑒別樣品的真?zhèn)蝺?yōu)劣。指要建立穩(wěn)定的中藥指紋圖譜必須規(guī)范原材料的來(lái)源，因此中藥指紋圖譜對(duì)中藥種植GAP實(shí)施起到指導(dǎo)監(jiān)督作用。

（二）指紋圖譜的構(gòu)建

構(gòu)建指紋圖譜的主要步驟：樣品采集、方法建立、數(shù)據(jù)分析、樣品評(píng)價(jià)和方法檢驗(yàn)。應(yīng)收集10批以上相互獨(dú)立、具有代表性的原料藥材和多批次半成品、成品樣品進(jìn)行分析，并且應(yīng)注意將與產(chǎn)品功能主治相關(guān)的有效部位盡可能完全地提取出來(lái)。測(cè)定指紋圖譜后，標(biāo)定各生產(chǎn)步驟指紋峰及相似度，即可起到對(duì)藥品從原料到成品進(jìn)行全過(guò)程質(zhì)量控制的作用。系統(tǒng)全面取樣后的提取成分應(yīng)盡可能全面。研究人員在找出各樣品共同成分的同時(shí)，更注重發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源（不同品種、產(chǎn)地或栽培條件）樣品問(wèn)的差異。

三、現(xiàn)代分析技術(shù)在指紋圖譜研究中的應(yīng)用

（一）薄層色譜（TLC）

薄層色譜法用固定波長(zhǎng)對(duì)薄層展開的各斑點(diǎn)作薄層掃描的掃描圖譜比目測(cè)的層析圖譜更為客觀準(zhǔn)確，還可計(jì)算各峰的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)峰的比作量化指標(biāo)，因而具有更好的指紋鑒別意義，是目前應(yīng)用最廣泛的建立指紋圖譜的方法。在新藥研制中，幾乎所有的新藥都必須提供薄層色譜，并需附有標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ账幉?、陰性樣品?duì)照的彩色圖片。在實(shí)際的薄層層析鑒別中，因藥用植物成分的性質(zhì)相近而難以分開時(shí)，還可采用高效薄層色譜法。微乳薄層色譜法（ME-TLC）是最新發(fā)明的一種技術(shù)。與傳統(tǒng)的TLC法中的有機(jī)溶劑相比，它具有無(wú)毒，不可燃，可操作性強(qiáng)，價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。由于其具有諸多優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于分析歐亞甘草屬（Glycyrrhiza）植物提取液。它的指紋圖譜就能清晰、完整地反映出不同種類的甘草，并能較好地揭示樣品中不同成分的特征

（二）高效液相色譜（HPLC）

HPLC具有分離效率高、分離速度快、定量精密度高、檢測(cè)器種類多穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，它比GC法應(yīng)用范圍更廣。HPLC指紋圖譜是現(xiàn)在應(yīng)用最多的一類，如運(yùn)用二極管陣列檢測(cè)器可得到三維圖譜。

（三）氣相色譜（GC）

氣相色譜具有分離效能高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，所得的色譜輪廓重現(xiàn)性好、分辨率較高，由于是封閉系統(tǒng)色譜，外界影響因素較少，故穩(wěn)定性較好，檢測(cè)設(shè)備可選性較大，特別適用于含揮發(fā)性成分中藥的指紋圖譜的研究和應(yīng)用。

（四）高效毛細(xì)管電泳（HPCE）

毛細(xì)管電泳已用于中草藥中生物堿、黃酮／黃酮苷、酚酸、香豆素、醌類、強(qiáng)心苷、葡萄糖異硫氰酸鹽等物質(zhì)的分析?！吨袊?guó)藥典》2005版收載了該方法，從而加速了該方法的研究和推廣。在中藥分析中最常用的兩種模式是毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）和膠束電動(dòng)毛管色譜（MECC）。

（五）高速逆流色譜（HSCCC）

高速逆流色譜是當(dāng)前國(guó)際流行的新型的液一液分配技術(shù)。它利用相對(duì)移動(dòng)的兩種互不相溶的溶劑，在處于動(dòng)態(tài)平衡的兩相中將具有不同分配比的組分分離，分離效能高、低成本、樣品的前處理簡(jiǎn)單，可適用于任何極性范圍樣品的分離，因此很適用于指紋圖譜分析。

（六）紫外（UV）、紅外（IR）光譜

紫外光譜是反映分子內(nèi)電子吸收紫外光和可見光波段的能量而產(chǎn)生躍遷的吸收光譜。中藥中一些含有不飽和結(jié)構(gòu)或共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的成分在紫外（通常是200-400nm）照射下，能引起物質(zhì)內(nèi)部原子、分子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的變化，不同物質(zhì)產(chǎn)生的紫外吸收光譜各部形同。由于不同中藥所含成分的不飽和程度有差異，因而其紫外吸收曲線的形態(tài)、峰位、峰強(qiáng)度也有差異，可以此進(jìn)行鑒定。但目前認(rèn)為，UV光譜僅能反映部分具有紫外吸收的化學(xué)成分，而要對(duì)藥物成分進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，還需結(jié)合IR、色譜等技術(shù)。紅外光譜是反映分子內(nèi)部各種鍵的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能給變化的吸收光譜。紅外光譜具有高度的特征性，每一種化合物都有自己特征的紅外光譜。中藥是一個(gè)含有多種化學(xué)成分的混合物，其紅外光譜是混合物中各組分在紅外光區(qū)域內(nèi)（400-4000cm-1）總體官能團(tuán)吸收的疊加。

（七）核磁共振波譜（NMR）

核磁共振是鑒定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的主要方法。通過(guò)一定程序獲了植物類中藥的特征性化學(xué)成分的總提取物，同時(shí)這些特征的化學(xué)成分的含量是相對(duì)固定的，則在規(guī)范的提取分離條件下，植物類中藥的NMR圖譜與植物品種存在著嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系。圖譜中的信號(hào)強(qiáng)弱反映了混合物中各組分的相對(duì)含量。

（八）X射線衍射法（XRD）

X射線衍射法是研究物質(zhì)的物相和晶體結(jié)構(gòu)的主要方法。當(dāng)對(duì)某一物質(zhì)進(jìn)行衍射分析時(shí)，該物質(zhì)被X射線照射而產(chǎn)生不同程度的衍射現(xiàn)象，物質(zhì)的組成、晶型、分子內(nèi)成鍵方式、分子構(gòu)型、構(gòu)象等將決定物質(zhì)產(chǎn)生特有的衍射光譜。如果該物質(zhì)是一混合物，則所得衍射圖是各組分衍射效應(yīng)的疊加。只要混合物的組成恒定，其衍射圖就可作為該混合物的特征譜圖。由于衍射法獲得的圖譜信息量大，指紋性強(qiáng)，穩(wěn)定可靠，因此可作為該物質(zhì)定性鑒別的可靠依據(jù)。但在進(jìn)行衍射分析時(shí)，由于每一中藥含有許多組分，每一成分含有衍射峰而產(chǎn)生相互疊加，最后獲得的衍射圖會(huì)因各組分衍射效應(yīng)的疊加而使衍射圖顯得較為復(fù)雜，從而給藥材鑒別帶來(lái)困難。

（九）色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

采用色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立多維多息特征譜，可使各圖譜間相互不存信息，對(duì)復(fù)雜供試品有更清晰完整的認(rèn)識(shí)。如GC-MS、HPLC-MS、HPLC-MS-MS等可提供大量的各種化學(xué)信息，符合解決中藥體系的要求。更重要的一點(diǎn)就在于為解決中藥研究中缺乏標(biāo)準(zhǔn)品的難題提供了一條可行之路。因?yàn)椴捎寐?lián)用技術(shù)就能確定混合物中各化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)。

四、指紋圖譜研究過(guò)程中存在的問(wèn)題

（一）藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性

中藥化學(xué)成分是植物次生代謝產(chǎn)物，對(duì)于同一種子，生態(tài)環(huán)境、栽培條件不同，產(chǎn)物的化學(xué)成分不一樣。由于藥用植物來(lái)源的無(wú)序性，新技術(shù)的應(yīng)用不能普及，標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化程度不夠而導(dǎo)致的重現(xiàn)性差、不利于指紋圖譜的研究應(yīng)用。只有加強(qiáng)藥用植物種植與提取加工的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，才能保證藥用植物提取物的質(zhì)量控制，在分析技術(shù)上還需要多學(xué)科的滲透，才能保證藥用植物提取物指紋圖譜的建立和實(shí)施。

（二）與藥理作用及臨床療效脫節(jié)

目前中藥的指紋圖譜的研究基本上反映的都是化學(xué)信息，而不是藥效信息，存在指紋圖譜與藥效脫節(jié)的現(xiàn)象，也是指紋圖譜最有爭(zhēng)議的地方。因此指紋圖譜的變化必然引起藥理作用的變化，今后應(yīng)加強(qiáng)指紋圖譜與藥效相關(guān)性研究，以期達(dá)到控制了指紋圖譜就保證了藥物療效的目的。

（三）指紋圖譜的技術(shù)問(wèn)題

在從藥材制劑的研究過(guò)程中，最好能分別制作中藥材、中間體和制劑的指紋圖譜。對(duì)于復(fù)方制劑，由于成分復(fù)雜，在一張圖譜不能反映全貌的情況下，可以分成幾張圖譜，用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒉煌瑯O性的成分分開，分別做成指紋圖譜。注射劑以水溶性成分為主，盡可能做成一張圖譜，不同的制備提取工藝可能會(huì)使提取的有效成分有差異。應(yīng)該分別比較不同工藝的圖譜，從而確定其共有峰和非共有峰。此外，在推行中藥指紋圖譜的同時(shí)，應(yīng)重視與加強(qiáng)藥物生產(chǎn)全過(guò)程各環(huán)節(jié)的管理控制，才能生產(chǎn)出品質(zhì)優(yōu)良的中藥產(chǎn)品。

（四）分析儀器在指紋圖譜應(yīng)用中的局限性

中藥色譜指紋圖譜的實(shí)驗(yàn)中各種儀器是互補(bǔ)，任何儀器不可能進(jìn)行所有藥材的分析，選擇方法應(yīng)視研究對(duì)象的實(shí)際需要和可能以及按照不同色譜技術(shù)的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)而定。薄層色譜的主要不足是“柱效”較低，靠細(xì)微特征方可鑒別的指紋特征，重現(xiàn)性及精密度差，靈敏度也不高，對(duì)外部環(huán)境條件（溫度、濕度）要求較高，操作要求規(guī)范熟練。揮發(fā)性成分當(dāng)以氣相色譜為主，但如何把握一個(gè)極為復(fù)雜的氣相色譜圖的處理是一個(gè)問(wèn)題。紫外可見光光度法和紅外光譜法所給出的信息是所有化學(xué)物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息的加和，不具備指紋特征，但可作為指紋圖譜研究的輔助方法。毛細(xì)管電泳的高分辨率也有其優(yōu)勢(shì)，大分子物質(zhì)可能更適合，但重現(xiàn)性需要特別注意。聯(lián)用技術(shù)由于其高昂的費(fèi)用而難于推廣。中藥指紋圖譜一般說(shuō)來(lái)是以HPLC指紋圖譜為最基本的方案。

五、展望

目前中藥指紋圖譜還處于方法學(xué)研究及數(shù)據(jù)積累階段，中藥指紋圖譜的應(yīng)用也僅限于生產(chǎn)中的質(zhì)量控制，因此建立中藥指紋圖譜，應(yīng)考慮其可操作性。隨著分析技術(shù)的快速發(fā)展，為中藥指紋圖譜的研究、應(yīng)用及完善提供了技術(shù)保證。今后應(yīng)該利用計(jì)算機(jī)容量大、速度快的特點(diǎn)，開發(fā)與分析儀器相配套的解讀指紋圖譜的分析軟件，使結(jié)果分析更科學(xué)合理。

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（作者單位：神華準(zhǔn)格爾能源有限責(zé)任公司黑岱溝實(shí)業(yè)公司。其中，蘇小平為助理工程師；全民為工程師）