黃精提取物對耐力訓練大鼠骨骼肌組織ＮＯ－ＮＯＳ體系影響的實驗研究

毛　雁　韓曉燕　熊正英　劉曉軍

摘要：目的: 探討黃精對不同負荷耐力訓練大鼠骨骼肌組織中一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)體系的影響，為黃精作為運動補劑的開發(fā)提供實驗依據。方法：選取雄性大鼠24只，隨機分為（A組）、運動對照組（B組）、運動+黃精提取物組（C組），B組和C組按照訓練模型進行為期6周的不同負荷的跑臺訓練，并測定大鼠骨骼肌組織中一氧化氮（NO），總一氧化氮（T-NOS），結構性型一氧化氮(cNOS)和誘導型一氧化氮(iNOS)活性以及力竭時間。結果：黃精提取物可以促進骨骼肌組織中產生生理劑量的NO；升高T-NOS、cNOS活性；抑制大強度力竭性運動導致的iNOS過量表達；延長大鼠運動至力竭的時間。結論：黃精提取物可以影響不同運動負荷狀態(tài)下骨骼肌組織NO-NOS的變化，改善組織代謝狀況，提高運動能力。

關鍵詞：黃精；耐力訓練；一氧化氮；一氧化氮合酶

中圖分類號：G804.7文獻標識碼：A文章編號：1007-3612(2008)09-1225-03

Experimental Research on the Effect of Polygonatum sibiricum Red.to NO-NOS System in

Skeletal muscles Tissues of Endurance-trained Rats

MAO Yan1, HAN Xiao-yan1, XIONG Zheng-ying2, LIU Xiao-jun3

(1.Department of physical education, Xi.an University of Architecture & Technology, Xi.an 710055, Shaanxi;2.Institute of

Sport Biological Research, Shaanxi Normal University, Xi.an 710061, Shaanxi China;

3.Department of Physical Education, Weinan Normal College, Weinan 714000, Shaanxi China)

Abstract:Purpose: This study discussed the mechanism of Polygonatum sibiricum Red impacting to myocardial mitochondrial antioxident ability and system of NO-NOS in trained- indurance Rats, which can provide examination base for using Polygonatum sibiricum Red as sport supplements. Methods: Twenty-four old male SD rat were randomly divided into four groups. Group B and C rats were experimented by building the Endurance-trained exercise model in mice to probe into the activities of the nitrous oxides (NO) and synthase (NOS) of skeleton muscle through 6-week different load running in the platform. Results: It indicate that the Polygonatum sibiricum Red can increase the activities of NO, T-NOS, cNOS activity; Inhibit the over-expression by intensity strength;Lengthen the time that the great mouse's movement exhausts to strength. Conclusion: Polygonatum sibiricum Red could influence the NO-NOS system's change of skeleton muscle under the different load, improve movement ability.

Key words: Polygonatum sibiricum; Endurance training; Nitrous oxides; Nitrous oxides synthas

現代醫(yī)學研究證明，黃精作為一種補氣益腎的中藥，具有較高的藥用價值。它含有糖類、蛋白質、氨基酸、蒽醌類、皂苷、生物堿、微量元素、氨基酸等多種成分。具有提高記憶力、增強免疫、抗氧化、保肝護肝、增強毛細血管張力等作用^［1］。NO-NOS體系作為近年來生命科學研究領域中的熱點之一，在我國運動醫(yī)學界的研究也逐步開展起來，在運動中，它與骨骼肌運動和代謝的調節(jié)、運動訓練后血管適應性變化、以及骨骼肌細胞的收縮功能有密切關系^［2-6］。為了探討黃精對大強度運動時機體NO-NOS體系的影響，使運動能力達到最大化，我們通過建立大強度跑臺動物運動模型，重點在于驗證并探尋黃精提取物對NO-NOS體系影響的可能機制，從而為黃精在運動營養(yǎng)學領域中的應用提供實驗依據。

1實驗研究

1.1實驗材料與實驗對象

1.1.1實驗材料黃精(Polygonatum sibiricum Red.)采制秋季采挖根莖，洗凈，除去須根，蒸至現油潤時，取出干燥。黃精提取物產品規(guī)格：10：1的提取物，由陜西昌岳植化技術有限公司提供。

1.1.2實驗對象Sprague-Dawley（SD）雄性健康大鼠24只，體重180～220 g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，同時購入基礎飼料。國家標準嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲食，飼養(yǎng)溫度(23±5)℃，相對濕度40%～70%，照明隨同自然變化，分籠適應性飼養(yǎng)7 d后進行實驗。

1.1.3給藥方法將黃精提取物懸浮于生理鹽水中，攪勻，用量為4.2 g/kg/d，劑量為2 mL，灌胃給運動加藥組，時間為每天上午8點，其它兩組灌服給同等量的生理鹽水作為對照，實驗共6周。

1.2實驗設計與方法將大鼠隨機分成安靜組（A組）、運動對照組（B組）、運動+黃精提取物組（C組），每組8只。大鼠自由攝食和飲水，照明時間隨同時間變化。A組安靜籠飼養(yǎng)，B、C組進行6周的跑臺訓練，每周訓練5 d，每天訓練前以15 m/min的速度做適應性運動5 min后正式訓練，訓練模型基于Bedford^［7］模型結合實際略加調整（具體訓練方案見表1）。運動組最后一次訓練至力竭，力竭判定標準^［8］：訓練過程中動物跟不上預定速度，大鼠臀部壓在籠具后壁，后肢隨轉動皮帶后拖達30秒，毛刷刺激驅趕無效。行為特征為呼吸深急、幅度大，神精疲倦，俯臥位垂頭，刺激后無反應。最后一次訓練后即刻處死，立即取出股四頭肌，用濾紙吸干，稱重，然后制備10%的勻漿液，離心（3 500 rpm，15 min，0～4℃），取上清液，在1～4℃的冰箱保存待測。

1.3測試指標與方法

1.3.1NO測定：硝酸還原酶法測定原理：本法利用硝酸還原酶特異性將NO-3還原為NO-2，通過顯色深淺測定其濃度的高低，計算NO含量（單位：μmol/g prot）。

1.3.2NOS測定：NADPH黃遞酶法測定原理：NOS催化L-Arg和分子氧反應生成NO，NO與親核性物質生成有色化合物，在530 nm波長下測定吸光度，根據吸光度的大小可計算出NOS的活力。單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成1nmolNO為一個酶活力單位（U）。

測試方法嚴格按照試劑盒使用說明書進行，計算公式等詳見試劑盒使用說明書。

1.4數據統(tǒng)計學處理┆所測實驗數據采用SPSS 12.0 for Windows軟件包處理，實驗結果以均數±標準差(玐±SD)表示, 進行組間t檢驗。顯著性差異選擇P<0.05和P<0.01水平。

2結果

2.1黃精提取物對耐力訓練大鼠骨骼肌組織NO-NOS體系的影響（表2）

表2顯示，運動對照組骨四頭肌中的NO、T-NOS和iNOS都有不同程度的升高，且NO有極顯著性差異（玃<0.01），iNOS有顯著性差異（玃<0.05）；cNOS 下降且有顯著性差異（玃<0.05）加入黃精提取物后，除了iNOS下降且有極顯著性差異之外（玃<0.01），其余指標均顯著性上升，并且T-NOS和cNOS有極顯著性差異（玃<0.01），NO有顯著性差異（玃<0.05）。

2.2黃精提取物對大鼠運動至力竭時間的影響（表3）

表3顯示，黃精提取物能顯著提高大鼠力竭的時間（玃<0.05），力竭延緩率高達22.81%，說明黃精提取物有較明顯的抗疲勞作用。

3討論

3.1黃精提取物對耐力訓練大鼠骨骼肌組織NO含量的影響NO作為內源性抗通透因子，可以舒張血管，增加組織血供，改善微循環(huán)和組織代謝狀況^{［9，10］}。同時，運動提高了血流對血管壁產生的剪切應力，增加NO的生成與釋放^［11］，有利于運動過程中營養(yǎng)物質的輸送和代謝產物的清除。本實驗結果顯示，運動后大鼠骨骼肌組織中的NO含量有明顯的升高趨勢，其機制有3個方面：1） 運動訓練中經常伴有大量的各種各樣的損傷發(fā)生，產生大量致炎細胞因子，誘導iNOS基因表達，使NO大量生成^［12,13］；2） 隨著運動強度的增加，血漿兒茶酚胺的濃度逐漸增加，并與血管內皮細胞上的腎上腺素能受體結合，可以刺激內皮細胞釋放NO；3） 隨著運動時心輸出量的增加和血液重新分配，導致骨骼肌血流量增加，必然增加血流對內皮細胞的切壓力，增加NOS活性，從而增加NO的含量。

加入黃精提取物后，與運動對照組比較，大鼠骨骼肌組織中的NO含量繼續(xù)升高，分析其機制可能是由于黃精中的黃酮幾種甙類成分以及多糖的抗氧化作用，使自由基生成減少，并增加其清除率，同時提高體內抗氧化酶活性，減輕自由基對內皮細胞的損傷。血管內皮功能改善后，細胞漿內Ca2+濃度增加，導致cNOS合成增加，進而導致NO合成增加；另外，由于運動過程中由于能量的消耗增多，ADP濃度增加，也可激活cNOS，使NO合成增加。這就說明在加入黃精提取物后更加有利于運動過程中營養(yǎng)物質的輸送和代謝產物的清除。

3.2黃精提取物對耐力訓練大鼠骨骼肌組織T-NOS活性的影響及其機制NOS是催化L-精氨酸和氧反應后生成一氧化氮，同時生成瓜氨酸的反應。運動訓練對T-NOS的影響隨運動強度和時間的變化而不同。本實驗結果表明，運動后即刻大鼠股四頭肌組織T-NOS顯著升高，其原因可能是長時間大強度的運動訓練使NOS的各分型的活性發(fā)生改變。股四頭肌組織T-NOS的顯著升高，有利于運動肌的血液供應，延緩外周疲勞。NOS是NO生成的關鍵限速酶^［14］，在一定運動強度訓練下，NO主要是由神經細胞持續(xù)合成的cNOS催化L-Arg而生成^［15］。本實驗顯示，黃精可使骨四頭肌T-NOS的活性有極顯著性升高，表明黃精能夠有效調節(jié)機體的NO-NOS系統(tǒng)。近幾年來的研究證明，黃精可通過調整神經遞質含量、神經遞質受體數量、促性腺及性腺激素含量、MAO、SOD、LPO等含量而產生明顯的延緩骨骼肌組織衰老的作用；其機制是由于黃精所含的多糖及黃酮類化合物的抗氧化作用，防護骨骼肌損傷，保護了骨骼肌的NOS活性，維持正常的總NOS活性水平，并從骨骼肌代謝方面證實了黃精提取物對骨骼肌的保護作用。

3.3黃精提取物對耐力訓練大鼠骨骼肌組織iNOS活性的影響及其機制在一定范圍內，iNOS基因對細胞因子應答反應的強度與細胞因子的濃度和(或)作用時間呈正比^［16］。生理狀態(tài)下，iNOS在人體內部不大量的表達，但在某些細胞因子如白細胞介素-1、干擾素、脂多糖等的誘導下，可大量的表達。iNOS一經誘導生成，其活性持續(xù)的時間較長，催化產生大量的NO，除了引起強烈的血管舒張和血壓降低，導致休克發(fā)生以外，還因生成過氧化亞硝酸陰離子(OONO-)，而對機體組織器官造成損傷。

本實驗結果顯示，運動后大鼠骨骼肌組織中的iNOS活性有明顯的升高趨勢。表明長期的運動訓練造成了機體骨骼肌組織出現暫時性供血不足，iNOS在大強度訓練中可能被過度激活，另外，由于運動過程中產生大量致炎細胞因子，誘導了iNOS基因表達，產生大量的iNOS^［17］。運動加黃精組與運動對照組比較，骨四頭肌組織中的iNOS活性有較顯著的下降，說明黃精提取物可以抑制大強度力竭性運動導致的iNOS過量表達。其機制是由于黃精提取物富含多種活性成分，可對骨骼肌組織NO及其合成酶系起到調節(jié)性作用，減輕NO介導的神經毒性及氧化損傷，并能夠通過增強毛細血管張力，改善毛細血管脆性，調節(jié)血管活性物質等作用。

3.4黃精提取物對耐力訓練大鼠骨骼肌組織cNOS活性的影響及其機制cNOS是由血管內皮細胞和神經細胞持續(xù)合成的NOS，主要分布于血管內皮細胞、平滑肌細胞，其活性依賴于Ca2+和鈣調蛋白（calmodulin，CaM），合成的NO通過激活糖皮質激素(glucocorticoid,GC)提高細胞cGMP濃度而參與人體多種生理機能的調節(jié)。本實驗結果顯示，運動后大鼠骨骼肌組織中的cNOS活性有明顯的下降趨勢，說明長時間的力竭性運動導致了cNOS的失活。其機制可能為：1） 大鼠在大強度訓練后，心肌細胞的肌漿網受到損傷破壞，這樣就減小了nNOS附著的表面積，因此檢測到較低的表達，其具體機制還有待于進一步探討。2） 長時間耐力運動使腦組織脂質過氧化程度明顯提高，超氧陰離子大量產生，與cNOS快速作用，從而減少骨骼肌組織cNOS活性；3） 長時間耐力運動中NO合成的底物L-Arg分解代謝加速，造成體內L-Arg 供給不足，引起cNOS合成的減少。補充黃精提取物后，骨四頭肌中的cNOS活性有極顯著性的增高，表明黃精提取物可以提高骨骼肌組織的cNOS活性，促進內皮依賴性的血管舒張反應，有利于骨骼肌器官的血供和氧供，促進代謝產物的運輸，從而為運動能力的提高提供了有利條件。

3.5黃精提取物對耐力訓練大鼠力竭時間的影響及其機制本實驗結果顯示，運動加藥組大鼠與運動對照組相比較，力竭運動時間延長了22.81%，表明補充黃精提取物可以提高大鼠的運動能力，延緩運動疲勞的發(fā)生。主要是因為黃精中含有糖類、蛋白質、氨基酸、蒽醌類、皂苷、生物堿、微量元素等多種成分，具有抗氧化、免疫促進作用。此外，黃精多糖硫酸脂PPS卻具有較強的抗氧化活性，可以通過改善組織功能來達到延緩疲勞的目的，增強大鼠的運動能力，微量元素還有利于維持運動中細胞內外的各離子濃度梯度，保護細胞膜及亞細胞器結構和功能的完整性，進而減輕和修復大強度耐力運動對機體的損傷，延長運動時間。

4結論

長期補充黃精提取物能夠有效地促進骨骼肌組織中NO、T-NOS、cNOS的活性；抑制大強度力竭性運動導致的iNOS過表達；延長大鼠運動至力竭的時間。因此補充黃精可以改善力竭訓練大鼠力竭運動后NO-NOS系統(tǒng)的狀態(tài)，舒張血管，增加骨骼肌血流量和攜氧量，從而提高運動能力。

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