間歇運動對大鼠骨骼肌凋亡基因Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２及相關(guān)因素的影響

陳德權(quán)　鄧樹勛　彭峰林

摘要：通過比較間歇運動中不同類型骨骼肌中氧自由基，線粒體Ca2+含量代謝情況，Bax，Bcl－2凋亡基因表達的差異，來探討間歇運動導致骨骼肌細胞凋亡的可能機制。24只SD大鼠，隨機分為安靜對照組（8只），一次間歇運動組（8只），長期間歇訓練組（8只）。運動后24 h取比目魚肌和脛骨前肌，采用RT－PCR方法檢測Bax，Bcl－2基因表達情況，并測定組織中SOD活性、MDA含量和線粒體鈣含量。結(jié)果表明：1） 一次間歇運動組脛骨前肌中Bax/Bcl－2比值顯著升高（P＜0．05），且Bcl－2表達顯著低于長期間歇訓練組（P＜0．05）。2） 運動后，脛骨前肌和比目魚肌中SOD活性均升高了，但僅一次間歇運動后脛骨前肌SOD活性較安靜時增加具有顯著性（增加48％，P＜0．05）。3） 一次間歇運動和長期間歇訓練后脛骨前肌中MDA含量均非常顯著性高于安靜對照組（P＜0．01）。4） 一次間歇運動后，脛骨前肌線粒體Ca2+含量較安靜時增加100％，差異非常顯著（P＜0．01），同時也顯著性高于比目魚肌中線粒體Ca2+含量（P＜0．05）。結(jié)論：1） 一次高強度的間歇運動可能主要通過快肌中Bax表達增強，Bcl－2表達減弱，氧自由基的升高，粒體內(nèi)鈣超載，共同致運動能力下降。2） 長期間歇訓練可能通過增強抗氧化能力，增強抗凋亡基因表達來增強運動能力。間歇訓練后，快慢肌應對細胞內(nèi)Ca2+升高的能力增強，這可能是間歇訓練增強運動能力的另一細胞內(nèi)信息轉(zhuǎn)導機制。

關(guān)鍵詞：間歇運動；Bax，Bcl－2；氧自由基；線粒體鈣

中圖分類號：G804.7文獻標識碼：A文章編號：1007-3612(2008)07-0922-04

細胞凋亡是細胞死亡的一種形式，研究細胞凋亡具有重要的生物學及生物醫(yī)學價值。Bcl-2作為一種抑制細胞凋亡的基因，它的表達可以抑制細胞凋亡；Bax是Bcl-2家族的另外一種促進細胞凋亡的基因，它的過表達可以拮抗Bcl-2的保護效應而使細胞趨于凋亡。Bax/Bcl-2的比值決定了細胞是否凋亡的命運［1］。線粒體途徑是介導細胞凋亡的一個重要途徑。線粒體中可產(chǎn)生大量的氧自由基，攻擊細胞膜造成脂質(zhì)過氧化，引發(fā)細胞凋亡；也可以由于線粒體內(nèi)鈣超載或線粒體膜電位的改變引發(fā)細胞凋亡。本研究以間歇運動為運動模型，通過檢測骨骼肌中Bax和Bcl-2的表達情況，同時測定反映骨骼肌組織內(nèi)氧化損傷的SOD活性和自由基水平的MDA含量，以及線粒體鈣含量來反映組織內(nèi)氧化損傷，線粒體鈣超載與細胞凋亡基因表達的關(guān)系，期望揭示高強度間歇運動導致細胞凋亡的機制，為運動訓練提供科學的理論依據(jù)。

1研究對象與方法

1．1研究對象與運動模型

1．1．1研究對象與分組三月齡清潔級雌性SD大鼠24只，購自中山大學醫(yī)學院動物實驗中心。體重(180．5±19．7)g。分籠飼養(yǎng)。將24只大鼠隨機分為3組：安靜對照組（n=8）；一次間歇運動組（n=8）；長期間歇運動訓練組（n=8）。

1．1．2運動方式（改良于Bowles,D．K等［2］）安靜對照組：平時不進行訓練，籠內(nèi)自由飲食，自由活動，最后同運動組一起處死并取材。

一次間歇運動組：訓練前進行一周適應跑臺訓練，速度逐漸遞增，但是到一周末時速度不能超過20 m/min。正式運動時采用16 m/min 和50 m/min各2 min。 5%grade的間歇運動，重復10次，45 min/d(包括5 min熱身運動)，運動一次。

長期間歇訓練組：在進行一周適應訓練后，進行運動方式同一次間歇運動組的訓練方式相同，每周訓練5 d，周三和周日休息，正式訓練共7周。

1．2動物取材與標本制備

1．2．1動物取材兩運動組大鼠在末次運動后24 h，同安靜組大鼠一起稱重，麻醉后，取后肢兩側(cè)比目魚肌和右側(cè)脛骨前肌，于生理鹽水中洗凈后，用吸水紙吸干水分。將脛骨前肌分成兩塊，一塊用于生化指標的檢測，一塊用于分子生物學實驗；左側(cè)比目魚肌用于生化指標的檢測，右側(cè)比目魚肌用于分子生物學實驗。所有的骨骼肌組織在分裝好后迅速置于液氮中冷凍保存。

1．3主要實驗儀器與試劑

1）智能型熱循環(huán)儀：PTC-200，美國；2）水平電泳儀（APOLLO），美國；3）全自動凝膠數(shù)碼成像系統(tǒng)及分析系統(tǒng)（SynGene GeneGenius ），美國；4）RT-PCR試劑盒，購于寶生物工程（TaKaRa）（大連）有限公司。5）瓊脂糖，西班牙。6）SOD活性檢測試劑盒，MDA含量檢測試劑盒，鈣測定試劑盒，考馬斯亮藍蛋白定量檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1．4指標檢測

1．4．1Bax、Bcl-2基因表達情況的檢測（RT-PCR方法）

1．4．1．1引物設(shè)計由Invitrogen（上海分部）設(shè)計與合成，設(shè)計的引物序列為：Bax引物序列(331bp)：引物上游5'-GGCG AATT GGAG ATGA ACTG-3' 引物下游 5'-GTCA CTGT CTGC CATG TGGG-3'；Bcl-2引物序列(550bp)：引物上游 5'-GTGG GATA CTGG AGAT GAAG ACT -3' ，引物下游5'- CAGC CAGG AGAA ATCA AACA G-3'；內(nèi)參照GAPDH引物序列(453bp)：引物上游5'-ACCA CAGT CCAT GCCA TCAC-3'，引物下游5'-TCCA CCAC CCTG TTGC TGTA-3'

1．4．1．2RNA的提取與目的基因的擴增取100 mg左右的骨骼肌組織采用Trizol 法抽提總RNA，在鑒定RNA的質(zhì)量后再按照RT－PCR試劑盒說明書上進行cDNA的合成和目的基因的擴增，其中Bax基因退火溫度為55℃，Bcl-2的退火溫度為53℃，GAPDH的退火溫度為57℃。采用1％的瓊脂糖凝膠電泳后，拍照并保存待日后分析。

1．4．2SOD活性，MDA含量測定骨骼肌中SOD活性，MDA含量，線粒體鈣含量測定均按照試劑盒說明書進行操作。

1．5統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS14．0進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示。數(shù)據(jù)的組間差異采用單因素方差分析，并用Tukey（圖凱法）進行多重比較，數(shù)據(jù)組內(nèi)差異采用配對樣本T檢驗，顯著性水平為P＜0．05，非常顯著為P＜0．01。

2實驗結(jié)果

2．1運動對骨骼肌中Bax和Bcl-2基因表達的影響

一次間歇運動后，脛骨前肌和比目魚肌Bax表達均較安靜時升高，而Bcl-2表達低于安靜對照組，兩者均無顯著性差異；同時，脛骨前肌中Bax表達的增幅和Bcl-2降低的幅度較比目魚肌大，且Bax/Bcl-2的比值顯著性高于安靜對照組。長期間歇訓練后，脛骨前肌中Bax表達增幅較比目魚肌中大，而比目魚肌中Bax中表達增幅較??；Bcl-2的表達于脛骨前肌和比目魚肌中較安靜時均有升高，但同樣均無顯著性；Bax/Bcl-2比值在長期間歇訓練后于脛骨前肌和比目魚肌均有所升高，但均無顯著性差異。兩運動組之間相比較，僅發(fā)現(xiàn)一次間歇運動后脛骨前肌中Bcl-2表達顯著低于長期間歇訓練后的值（P＜0．05）。

2．2運動對骨骼肌組織中SOD活性和MDA含量的影響安靜狀態(tài)下，大鼠比目魚肌中SOD活性高于脛骨前肌，差異顯著（P＜0．05）；而脛骨前肌中MDA含量又顯著性高于比目魚?。≒＜0．05）。經(jīng)過運動后，比目魚肌和脛骨前肌中SOD活性均升高了，比目魚肌中SOD活性增幅較??；脛骨前肌中SOD活性增幅則較大，其中一次間歇運動組增加48％（P＜0．05）,長期間歇訓練組增加24％（P＞0．05）。而經(jīng)過兩種方式的運動后，比目魚肌中MDA含量基本無變化，而脛骨前肌中MDA含量均較運動前大幅增加：一次間歇運動增加66％（P＜0．01）；長期間歇訓練組增加43％（P＜0．01），差異均非常顯著。經(jīng)過兩種方式的運動后，脛骨前肌與比目魚肌中MDA含量的差異比安靜時更大了，差異非常顯著（P＜0．01）。

2．3運動對骨骼肌線粒體內(nèi)Ca2+含量的影響一次間歇運動后，脛骨前肌線粒體中Ca2+濃度較安靜時增加了100％，差異非常顯著（P＜0．01），并且高于比目魚肌中Ca2+含量，差異顯著（P＜0．05）。長期間歇訓練后，快肌和慢肌中Ca2+含量與安靜時相持平，差異不顯著。兩運動組之間比較，脛骨前肌中Ca2+含量在一次間歇運動后非常顯著性高于長期間歇訓練組（P＜0．01）。

3討論

3．1運動對大鼠骨骼肌細胞凋亡基因的影響B(tài)ax和Bcl-2是細胞凋亡過程中兩個重要的調(diào)控基因。Bax的過度表達會促進細胞凋亡，而Bcl-2的表達增強則會抑制細胞凋亡。Bax/Bcl-2比值決定了細胞的命運，當比值大于正常值時，細胞則趨于凋亡，當比值小于正常值時，凋亡則受到抑制。國內(nèi)外的許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在衰老，骨骼肌營養(yǎng)不良，去神經(jīng)肌萎縮等過程中，骨骼肌細胞發(fā)生凋亡的同時，Bax，Bcl-2的表達發(fā)生了重要變化，并且兩者的變化趨勢相反［3-10］。

在本實驗研究的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，運動結(jié)束后24 h，一次間歇運動組大鼠快慢肌中Bax表達都較安靜對照組升高了，Bcl-2的表達則都下降了，但是各組間及組內(nèi)都沒有顯著性差異。上述變化的趨勢在快肌中表現(xiàn)得更明顯，這也就構(gòu)成了Bax/Bcl-2比值在一次間歇運動后顯著性高于安靜對照組。這樣的研究結(jié)果與Podhorska-Okolow M等（1998）的研究結(jié)果很相似，其在研究結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)，小鼠在進行一夜的自發(fā)轉(zhuǎn)輪跑后出現(xiàn)骨骼肌細胞凋亡，同時Bcl-2表達下降，Bax表達增強，并且Bax的表達程度與細胞凋亡的程度高度相關(guān)［11］，說明Bax的表達在誘導細胞凋亡方面起重要作用。本實驗再次證實了過強的運動會導致Bax表達增強，而Bcl-2表達下降，并且由于運動方式的原因，間歇運動中起主要作用的快肌中Bax,Bcl-2表達的這種趨勢體現(xiàn)的更明顯，這也提示一次高強度的間歇運動對快肌的刺激作用更大，會導致快肌細胞凋亡發(fā)生的可能性更大，這可能是一次間歇運動中通過凋亡相關(guān)基因調(diào)控引起骨骼肌細胞凋亡增加導致疲勞的一種基因機制。

同時，本研究結(jié)果也顯示，經(jīng)過長期的間歇訓練后，快慢肌中Bax表達較安靜時升高，但略低于一次間歇運動后的值，Bcl-2的表達在訓練后升高，且顯著高于一次間歇運動組。同時Bax/Bcl-2比值雖高于安靜對照組，但與一次間歇運動組相比卻下降了，同樣上述變化于快肌中體現(xiàn)得更明顯。而在Song W等（2006）和Siu PM（2004）等的研究中則發(fā)現(xiàn)經(jīng)過長期的耐力訓練或者中等強度的運動訓練后，Bcl-2表達相比對照組大鼠顯著增加，而Bax，Bax/Bcl-2比值都降低了［10，12］。同時Song W等檢測到DNA碎片梯形條帶減少，而Siu PM等檢測到運動組骨骼肌中DNA碎片較對照組增加，但無顯著性差異。他們的研究結(jié)果存在些差異可能主要與訓練的時間長短有關(guān)。本研究結(jié)果中Bax表達與上述研究結(jié)果有不同之處，可能也主要是訓練時間較他們的短的緣故。而本研究結(jié)果也在一定程度上顯示了長期間歇訓練后骨骼肌細胞凋亡程度的降低。同時，本研究結(jié)果中一次間歇運動引起B(yǎng)ax/Bcl-2的比值升高，而長期間歇訓練后Bax/Bcl-2比值又下降了，這樣的基因表達趨勢可能與黃穎峰，鄭師陵和王長青長期運動訓練過程中骨骼肌細胞凋亡率先增加后降低的趨勢存在因果關(guān)系［13-16］。這也可能是長期間歇訓練過程中通過降低促凋亡基因的表達，而增強抗凋亡基因的表達以增強運動能力的一種基因機制。

3．2運動后氧自由基代謝與Bax及Bcl-2表達人體或動物機體在劇烈的運動后會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如H2O2，NO，超氧陰離子(O2-)等。這些活性氧分子是氧自由基的來源，它們可以通過一系列的途徑誘導細胞凋亡，如氧自由基引起的DNA損傷可激活P53基因引起細胞凋亡，氧自由基形成的氧化應激可活化核轉(zhuǎn)錄因子NF－КB和AP－1，可加速細胞凋亡相關(guān)的一些基因的表達，誘發(fā)細胞凋亡［17］。另外，當ROS在線粒體內(nèi)大量釋放后，可引起B(yǎng)ax和Ced-4與Bcl-2的分離，使Ced-4與Bax參與隨后的細胞凋亡發(fā)生［1］。

本研究發(fā)現(xiàn)，安靜狀態(tài)下比目魚肌中SOD活性顯著高于脛骨前肌，與周婕的研究結(jié)果具有一致性［18］。比目魚肌中MDA含量較脛骨前肌中低，可能是由于慢肌中線粒體含量多，對自由基的抵抗和清除能力都較快肌強。經(jīng)過一次間歇運動后，比目魚肌和脛骨前肌中SOD活性以及MDA含量均升高了，但是只有脛骨前肌中SOD活性和MDA含量比安靜對照組增加具有顯著性，這樣的研究結(jié)果與先前的諸多研究結(jié)果存在相似之處［18-21］，同時本研究結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)，Bax表達在一次間歇運動后增加與SOD活性和MDA含量的變化存在一致性，而Bcl-2表達的變化則與SOD活性和MDA含量的變化相反，并且這種趨勢在快肌中體現(xiàn)得更明顯，提示間歇運動后，快肌中活性氧產(chǎn)生增多，脂質(zhì)過氧化程度增大，引起與加速了Bax與Bcl-2的分離，使骨骼肌趨向凋亡，運動能力下降。而慢肌纖維中由于SOD活性，MDA含量在間歇運動后與安靜對照組相比均無顯著性差異，說明間歇運動后氧自由基損傷在慢肌纖維中促凋亡的作用不大。

經(jīng)過長期間歇訓練后，快肌中SOD活性，MDA含量均較安靜時升高了，而只有MDA的增幅具有顯著性差異。而慢肌中這三項指標均無顯著性差異。同時研究結(jié)果也顯示，間歇訓練后，脛骨前肌和比目魚肌中Bax和Bcl-2表達均較安靜對照組增加，而Bax表達則相對一次運動組下降，Bcl-2的表達相對一次運動組增加。這樣的研究結(jié)果，一方面再次證實了前人關(guān)于長期進行中等強度或者有氧運動后，機體的抗氧化能力會增強［22-26］。

3．3運動后線粒體內(nèi)Ca2+含量與Bax及Bcl-2表達激烈運動會對骨骼肌產(chǎn)生較大的刺激，在急性運動后，骨骼肌肌漿網(wǎng)(SR) Ca2+－Mg2+－ATP酶以及SR Ca2+-ATP酶水解活性均會降低，同時肌漿網(wǎng)對Ca2+轉(zhuǎn)運能力也會明顯下降［27-28］,引起細胞質(zhì)中的Ca2+濃度短暫升高，對Ca2+極度敏感的線粒體則會加大對Ca2+的攝取速率，線粒體攝取Ca2+曲線左移，這樣細胞質(zhì)中的Ca2+濃度則會降低，而線粒體內(nèi)Ca2+則會升高［29-30］。而Ca2+則能結(jié)合線粒體通透性孔（MPTP）上的金屬結(jié)合位點，開放MPTP，從而導致滲透壓的改變，ATP的耗竭，細胞色素C釋放，活化Caspase-9和Caspase-3，從而誘發(fā)細胞凋亡［31］。Bcl-2作為抑制凋亡的基因，它可以通過阻止細胞色素C從線粒體釋放出來而抑制細胞凋亡；而Bax則通過與線粒體上的膜通道結(jié)合來促使細胞色素C的釋放而促進細胞凋亡［32］。

本研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過一次間歇運動后，快肌線粒體內(nèi)Ca2+含量較安靜對照組非常顯著性升高，而慢肌線粒體中Ca2+濃度雖然升高，但無顯著性。造成這種差異的原因可能是高強度的間歇運動后快肌肌漿網(wǎng)攝取Ca2+的能力和Ca2+－ATP酶活性下降比慢肌更多［33］，進而引起快肌線粒體中Ca2+含量較慢肌中高。一次間歇運動后，快肌中線粒體內(nèi)Ca2+濃度升高，Bax表達增強,Bcl-2表達減弱，造成運動能力下降，這可能是一次間歇運動一方面造成線粒體鈣超載，造成MPTP的開放，引起線粒體跨膜電位的降低而誘發(fā)細胞凋亡，或者導致誘發(fā)細胞凋亡的因素如細胞色素c等進入細胞質(zhì)，導致細胞凋亡；另一方面，Bax表達增高，而Bcl-2表達降低，促進細胞色素C等促凋亡因子得以釋放，兩方面因素共同促進細胞凋亡，致使運動能力下降。

長期間歇訓練后，快肌和慢肌線粒體中Ca2+含量差異不顯著。而兩運動組間比較，則發(fā)現(xiàn)長期間歇訓練后，快肌線粒體Ca2+含量明顯低于一次間歇運動組，而慢肌線粒體Ca2+含量雖低于一次間歇運動組，但是不能發(fā)現(xiàn)顯著性差異。這可能與大鼠對運動的適應引起Ca2+－ATPase活性以及肌漿網(wǎng)攝取Ca2+能力均增強有關(guān)［34］，并且長期間歇訓練可能使快肌中Ca2+－ATPase活性升高更多。提示長期間歇訓練后，骨骼肌細胞應對細胞內(nèi)Ca2+濃度增加的能力增強，這可能是骨骼肌運動能力增強的關(guān)鍵因素。

4結(jié)論

1) 一次高強度的間歇運動可能主要通過快肌中Bax表達增強，Bcl-2表達減弱，氧自由基的升高，粒體內(nèi)鈣超載，共同致運動能力下降。

2) 長期間歇訓練可能通過增強抗氧化能力，增強抗凋亡基因表達來增強運動能力。間歇訓練后，快慢肌應對細胞內(nèi)Ca2+升高的能力增強，這可能是間歇訓練增強運動能力的另一細胞內(nèi)信息轉(zhuǎn)導機制。

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