土壤中有益放線菌的高效分離、篩選和生物測定技術(shù)

黃世文　高成偉　王　玲　王全永

摘要：結(jié)合他人經(jīng)驗和近年作者的實際工作，本文系統(tǒng)介紹了土壤標本的采集、處理，放線菌的分離、純化。放線菌分離物及其代謝產(chǎn)物對病原菌(真菌、細菌)、害蟲和雜草的生物測定、評價，為研發(fā)微生物農(nóng)藥打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：土壤標本；放線菌；分離；生物測定

中圖分類號：Q 939．132

放線菌是產(chǎn)生抗生素活性物質(zhì)最大的、具有很大經(jīng)濟價值的一類原核微生物。迄今，在工業(yè)、醫(yī)學和農(nóng)業(yè)上都有許多利用抗生素的成功實例。我國自20世紀50年代就開始研究利用抗生素，在農(nóng)業(yè)上主要是防治各種作物的病蟲害，如5406防治土傳病害，推廣面積曾達667萬hm²以上；井岡霉素防治水稻、麥類紋枯病、菌核病等，每年應用面積1 333萬hm²以上，自投放市場以來已30多年，一直對紋枯病高效，未發(fā)現(xiàn)抗藥性。阿維菌素自20世紀90年代投放國內(nèi)市場以來，已逐步成為繼Bt制劑、井岡霉素之后生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的支柱產(chǎn)品，為我國生物農(nóng)藥市場贏得了巨大商機。國內(nèi)至今已完成登記阿維菌素產(chǎn)品80多個，是明確最具發(fā)展?jié)摿Φ纳镛r(nóng)藥之一。放線菌及其產(chǎn)生的抗生素的研究、開發(fā)與應用取得了巨大的社會、經(jīng)濟和生態(tài)效益。

放線菌大量存在于土壤中，從土壤中分離、純化、快速篩選目標放線菌是抗生素開發(fā)、應用的基礎(chǔ)。下面結(jié)合他人經(jīng)驗和作者近年的實際工作，從土壤采集、處理、菌株分離、純化，放線菌及其代謝產(chǎn)物對病原菌、害蟲、雜草等的生物測定等方面作一介紹。

1放線菌的分離

1．1土壤標本的采集

放線菌屬好氣性微生物，主要生活在較干燥、透氣性好、中性到微堿性、有機質(zhì)豐富的土壤中，特別是在我國南方熱帶及亞熱帶地區(qū)肥沃的土壤中，防線菌種類豐富。采集土壤標樣時，應根據(jù)放線菌的生活特性，有針對性地進行采樣。宜選擇菜地、茶園、果園等地采樣。選定采樣地點后，先鏟去表層土，挖取5～30 cm深的土壤數(shù)十克，裝入牛皮紙信封，封好袋口；潮濕的土壤宜裝入塑料袋或鋁盒內(nèi)，做好編號記錄，帶回實驗室供分離用。

采回的土壤標本一般宜及時進行分離，如不能做到隨采隨分，宜將土壤放在陰涼、通風干燥處，使其風干，保藏備用，但保藏時間不宜過長。

放線菌的分離方法很多，這里主要介紹分離普通放線菌的彈土法和稀釋畫線法。

1．2放線菌的彈土分離法

1．2．1分離培養(yǎng)基

分離放線菌常用的培養(yǎng)基主要有：

a．高氏1號培養(yǎng)基：可溶性淀粉2.0％、K₂HPO₄0.05％、NaCl 0.05％、KNO₃0.1％、MgSO₄·7HO₂0.05％、FeSO₄0.001％、瓊脂1.5％～2.0％、pH 7.2～7.4、在121℃(15磅)高溫高壓滅菌20 min。

b．葡萄糖——天門冬素瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖1.0％、天門冬素0.05％、牛肉膏0.2％、K₂HPP₄0.05％、瓊脂2.0％、pH6.8或自然、8磅滅菌30 min。

c．精氨酸一甘油瓊脂培養(yǎng)基：精氨酸0.1％、甘油1.25％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄·7H₂0 0.05％、NaCl0.1％、ZnSO₄·7H₂O0.000 1％、CuSO₄·5H₂O0.000 1％、Fe₂(SO₄)₃·6H₂O0.001％、MnSO₄·H₂O0.000 1％、瓊脂2.0％，pH 9.0，8磅滅菌30 min。

1．2．2平板培養(yǎng)基制備

根據(jù)分離量多少，準備好消毒高氏一號培養(yǎng)基500 mL或1 000 mL，滅菌的7 cm或9 cm直徑培養(yǎng)皿中倒入10～20 mL培養(yǎng)基，制成平板備用。

1．2．3土壤準備與接種

將土壤用研缽研細，60目過篩，取一定量細土平鋪于滅過菌的光滑硬紙板上，紙面積略大于培養(yǎng)皿的口徑，將多余的土輕輕傾去，見紙板上有一層細土粒粘附著則較為理想。接種時將倒好培養(yǎng)基的皿蓋微微揭開，將土壤紙板粘土面向下輕輕插入覆蓋其上，用皿蓋微微觸動一下紙板并立刻抽出，蓋好皿蓋即接種完畢。取下的土壤紙板，還可用于第2、第3及第4套分離培養(yǎng)皿接種。用于第2套接種時，輕輕彈動一下紙板；用于第3、第4套皿接種時，可在紙板背面稍加重彈力，使粘附于紙板上殘留的少量土粒落下，達到控制理想的出菌率。

如果要分離罕見的放線菌，如小單孢菌、小雙孢菌．游動放線菌或嗜熱放線菌等，則可將土壤研細后作干熱處理(120℃下處理1 h)。這樣在分離時可以大大降低細菌、霉菌和鏈霉菌的數(shù)量，使罕見的放線菌出現(xiàn)的比率提高。

1．3稀釋分離法

此法的準備工作與彈土法相同，但稀釋比應根據(jù)土壤中放線菌數(shù)量的多寡來決定。因此，往往在正式分離前需做一次預備分離試驗，找出適當?shù)南♂尡?。通過預備分離試驗，可以觀察到不同的土壤中放線菌、細菌和霉菌的數(shù)量關(guān)系，啟示在分離工作中應采取何種對策。若土壤中細菌和霉菌過多時，可考慮在分離培養(yǎng)基中加入相應的抑菌劑。如抑制霉菌可加制霉菌素(50單位／mL)或多菌靈(30單位／mL)抑制細菌可加鏈霉素(25～50單位／mL)等。

稱取研細的土壤5 g，加入盛有45 mL滅菌水的三角瓶中，充分振蕩，制成10^-1土壤濃度懸浮液。待土粒沉淀后，吸取1.0 mL上清液，移入盛有9 mL滅菌水的試管中，制成10^-2土壤濃度懸浮液。依此類推，制成10^-3、10^-4和10^-5土壤濃度懸浮液，從土壤中分離放線菌多采用10^-3～10^-5土壤濃度。通常吸取上述3種濃度懸浮液0.1 mL(約2滴)，加到分離培養(yǎng)基平板上，用滅菌涂布棒涂均。

1．4放線菌培養(yǎng)、挑菌和純化

將上述接種好的培養(yǎng)皿倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。若分離嗜熱放線菌，則應放在45～50℃下培養(yǎng)。3～4 d后即可長出放線菌單菌落。

在分離放線菌之前，必須學習、了解放線菌的形態(tài)特征、顏色等。初次分離，如果沒有固定目標菌類，應將所有的放線菌單菌落都及時轉(zhuǎn)接到高氏一號瓊脂或葡萄糖一天門冬素瓊脂斜面上，進行純化

培養(yǎng)。一般鏈霉菌的菌落大，氣生菌絲豐茂，色澤多種多樣；而小單孢菌、諾卡氏菌、游動放線菌等菌落小，光禿無氣生菌絲，色澤鮮艷。應注意選留后幾類放線菌，在教學上可豐富分類學實驗內(nèi)容，同時也可為篩選新抗生素或酶制劑等提供菌源。

如果細菌、霉菌干擾不嚴重時，可延長分離平板的培養(yǎng)時間，讓一些生長速度慢的放線菌陸續(xù)地生長出來，分批挑菌。一般純化培養(yǎng)7～14 d，待生長成熟后終止培養(yǎng)，編號登記，備用。

2放線菌的生物測定

經(jīng)純化培養(yǎng)的放線菌有否生產(chǎn)實用價值，即其代謝產(chǎn)物是否對有害生物(在農(nóng)業(yè)上主要指病蟲草)有毒性，需要通過生物測定來確定。放線菌的生物測定，不同的對象測定方法不同，一般是用放線菌的發(fā)酵代謝產(chǎn)物進行測定。下面將從放線菌發(fā)酵培養(yǎng)、代謝產(chǎn)物的提取、對病原菌、害蟲和雜草的生物測定等方面作一介紹。

2．1放線菌的發(fā)酵培養(yǎng)基

(1)日本培養(yǎng)基：2.5％葡萄糖、1.0％大豆粉、0.4％KC1、0.25％酵母提取汁、0.1％牛肉膏、0.5％(NH₄)₂SO₄、0.02％K₂HPO₄、0.3％CaCO₃(消毒前pH調(diào)至7.2)。(2)中國農(nóng)大培養(yǎng)基：2％淀粉、0.1％KNO₃、0.066％K₂HPO₄·7H₂O、0.05％Mg-SO₄·7H₂O、0.05％NaCl、0.001％FeSO₄、pH7.2。

2．2發(fā)酵培養(yǎng)及離心上清液的提取

250 mL三角瓶中每瓶裝100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，高溫高壓消毒20 min，冷卻備用。每瓶中接入培養(yǎng)7 d的放線菌菌塊(d=0.9 mm)2～4塊。在28～30℃恒溫搖床上以120～150 r／min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)7 d，發(fā)酵液在離心機上以1 500 r／min離心10 min，取上清液裝入消毒瓶中，加少許防腐劑保存?zhèn)錅y。沉淀物(菌絲團)裝另一消毒瓶，加等體積分析純丙酮浸提24 h，以同樣方法離心，取上清液，備測。

2．3放線菌發(fā)酵液對有害生物的生物測定

2．3．1發(fā)酵液對病原菌的毒性測定

2．3．1．1對真菌的生物測定

一般是將放線菌發(fā)酵上清液與被測菌的培養(yǎng)基混合，配成不同濃度的發(fā)酵液培養(yǎng)基，倒入直徑9 cm消毒培養(yǎng)皿，制成平板，同時以空白發(fā)酵培養(yǎng)基離心上清液和無菌水代替發(fā)酵上清液，與被測菌培養(yǎng)基混合作為對照。將生長一致的7 d菌齡被測菌菌塊(d=0.6～0.8 cm)接入平板中央；也可取0.1 mL放線菌發(fā)酵液培養(yǎng)基平板上，用消毒三角玻棒涂布均勻，直接將被測病原菌塊接入平板中央，有菌一面朝下。接種后置恒溫培養(yǎng)箱(溫度視不同的菌而定，一般多為28℃)培養(yǎng)，每隔1天按十字交叉法測量菌落直徑，并觀察菌落顏色、生長情況，菌核有無生成等，直到對照菌落長滿培養(yǎng)皿為止。

2．3．1．2對細菌的生物測定

細菌與真菌有所不同，一般是將被測細菌與該菌的培養(yǎng)基混合，充分搖勻，制成含細菌培養(yǎng)基平板。用0.7 cm直徑的打孔器將定性濾紙打孔，圓紙片消毒后備用。將放線菌發(fā)酵離心上清液配成不同濃度，同樣以空白發(fā)酵培養(yǎng)基離心上清液和無菌水為對照。圓紙片蘸發(fā)酵離心上清液或?qū)φ找?，紙片充分浸濕，放入時不滴液為宜，放人含細菌培養(yǎng)基平板中央。置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中宜保持較高的濕度(RH＞85％)，以免“藥紙片”很快干燥，影響藥效。每隔1天按十字交叉法測量1次抑菌直徑，并觀察抑菌圈的清晰度，一般至少測量5次。

最后通過計算真菌菌落大小和對細菌的抑菌圈大小來評價放線菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物對病原菌的毒性。真菌菌落越小，細菌抑菌圈越大，說明放線菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物毒性強，反之則相反。

一般的，由于對分離到的放線菌到底哪種類型菌對病原菌有效，哪種菌無效，心中無底，而且初分離到的菌種數(shù)量較多。為減少發(fā)酵、離心等的工作量和費用，對初次分離到的菌株最好采用對峙培養(yǎng)法進行初步測定。只有那些經(jīng)初步測定，對病原菌具有較強抑制活性的菌株才進行發(fā)酵培養(yǎng)、離心提取上清液作測定。當然有些放線菌可能對峙培養(yǎng)效果好，而發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)毒差，有些菌則相反，造成誤選或淘汰一些有潛力的菌株。

2．3．2發(fā)酵液對害蟲毒性的測定

放線菌發(fā)酵液對害蟲的毒性測定可分為觸殺和胃毒作用進行。

2．3．2．1胃毒作用測定

方法1：將發(fā)酵液配成不同濃度藥液，將供試害蟲喜食的寄主植物葉或莖在藥液中浸30～60 s(視植物類型而定，表面蠟質(zhì)多的植物浸的時間要長些)，使表面濡濕，懸掛晾干不滴液，置入大培養(yǎng)皿或大試管，放入供試蟲，每皿5～10頭(條)(視蟲量和培養(yǎng)皿及試管大小而定)，蓋上皿蓋或一層紗市封口。每處理重復3次，每隔一定時間觀察、描述試蟲的活動、取食情況，記錄死蟲數(shù)。

方法2：對于蠶、菜青蟲或小菜蛾等食葉昆蟲的測定，可采用以下方法：將2片供試蟲寄主植物葉片正面涂藥，將涂藥葉面相對疊合，并用大頭針嚴密訂緊，將葉邊緣修剪整齊，以免蟲子接觸藥液，使蟲子只能通過取食才能接觸藥液，每隔一定時間觀察、描述試蟲的活動、取食情況，記錄死蟲數(shù)。

2．3．2．2觸殺作用測定

方法1：將供試蟲不取食的作物葉片正面、或塑料片用不同濃度的發(fā)酵液涂布，待藥液干后，將供試蟲放在上面，讓其爬行，但不取食，幾分鐘后移入寄主葉片上，讓其取食，正常飼養(yǎng)，每隔一定時間觀察、描述試蟲的活動、取食情況，記錄死蟲數(shù)。

方法2：供試蟲飼養(yǎng)在寄主植物上，用喉頭噴霧器將不同濃度的發(fā)酵液直接噴霧在試蟲體表，每隔一定時間觀察、描述試蟲的活動、取食情況，記錄死蟲數(shù)。上述試驗均需設空白發(fā)酵培養(yǎng)基離心上清液和無菌水作對照，如能增設一個供試蟲常用防治藥劑作對照則更好。

2．3．3發(fā)酵液對雜草毒性的測定

將待測雜草種子用溫水預浸24～48 h(視不同雜草種而定)備用。將放線菌發(fā)酵離心上清液配成不同稀釋濃度，設空白發(fā)酵培養(yǎng)基離心上清液和無菌水為對照。

2．3．3．1測定發(fā)酵液對雜草種子發(fā)芽率的影響

挑10粒飽滿一致、預浸過的雜草種子放入不同濃度發(fā)酵離心液中浸24 h，撈出后分別置于用相同發(fā)酵液濃度浸過的吸水紙或濾紙上，放人培養(yǎng)皿，蓋上蓋，在30～35℃下催芽，每隔1天記錄種子的發(fā)芽情況，觀察芽的生長狀況，并作描述。觀察3～4次(6～8 d)，每處理最少重復3次，最終統(tǒng)計發(fā)芽率。

2．3．3．2測定發(fā)酵液對雜蘋根、芽生長的影響

將預浸過的雜草種子在30～35℃下催芽至露白，挑10粒芽長及生長基本一致的種子放入不同濃度發(fā)酵離心液中，在30℃恒溫下培養(yǎng)，分別在3 d和6 d天測量雜草根、芽長，同時觀察根、芽生長情況，如生長是否健壯，有無須根，顏色是否正常，并作描述。

所獲數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析后，即可初步判斷某一放線菌是否具有開發(fā)、應用價值，是否值得進一步研究。