小型昆蟲蛋白圖譜檢測方法的比較研究

褚　棟　張柱亭　安志蘭　郭篤發(fā)　周洪旭

摘要：以煙粉虱[Bemisia tabaci(Gennadius)]和溫室白粉虱[Trialeurodes vaporariorum(westwood)]小型昆蟲為研究對象，比較了這些小型昆蟲可溶性蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的檢測方法。結(jié)果表明，改進(jìn)的復(fù)合銀染法在蛋白質(zhì)檢測中具有效果好、簡單快捷的特點。

關(guān)鍵詞：煙粉虱；溫室白粉虱；可溶性蛋白；復(fù)合銀染法

中圖分類號：Q 599

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)是蛋白質(zhì)分析中最常用的手段之一。SDS-PAGE分離后的蛋白質(zhì)條帶，通常用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色，但是該方法靈敏度相對不高，背景較深。20世紀(jì)70年代產(chǎn)生了一種更為敏感的染色方法——銀染法。近幾年，又相繼報道了許多改進(jìn)的銀染方法，包括二胺銀染法、無二胺銀染法、照相銀染法、負(fù)片銀染法、正片銀染法和海波銀染法。目前，對染色方法改進(jìn)主要集中在如何提高蛋白質(zhì)染色的靈敏度，操作方便與否，費用是否昂貴等方面。如何在保持銀染方法高靈敏度的同時，又能夠有效地降低染色背景，用無毒的化學(xué)物質(zhì)去替換現(xiàn)在凝膠電泳中常用的有毒物質(zhì)等，代表了蛋白質(zhì)條帶染色的未來發(fā)展方向。

在昆蟲蛋白電泳染色方面，已有研究表明海波銀染法在家蠅幼蟲蛋白電泳中具有效果較好、簡便快速的特點。而對于小型昆蟲可溶性蛋白電泳檢測的染色方法報道較少，該方面的研究對于小型昆蟲物種鑒定、生理代謝等研究具有重要的實用價值。本研究以北方兩種小型昆蟲煙粉虱[Bemisia tabaci(Genadius)]和溫室白粉虱[Trialeurodes va po-rriorum(Westwood)]作為研究對象，分別使用了常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色法、海波銀染法、改進(jìn)的復(fù)合銀染法(考馬斯亮藍(lán)染色后再用海波銀染法染色)3種方法進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明改進(jìn)的復(fù)合銀染法得到的膠片底色淺、條帶清晰、檢測靈敏度高、相關(guān)性好，是一種較好的染色方法。并使用這種方法對煙粉虱、溫室白粉虱成蟲的生理代謝進(jìn)行了初步比較研究。

1材料與方法

1．1供試蟲源及寄主植物

煙粉虱室內(nèi)繼代飼養(yǎng)，供試植物茄子由本實驗室種植。溫度為(27±1)℃，相對濕度(RH)為70％～80％，光周期為L∥D=14 h∥10 h。溫室白粉虱為田間苘麻種群。

1．2可溶性蛋白的制備及SDS-PAGE

取1頭粉虱成蟲置于PCR管中，用15 μL蒸餾水做裂解液，粉碎后4℃，12 OOO r／min離心15 min，取上清液作為蛋白質(zhì)待測液。凝膠采用Tris-HCl緩沖體系，分離膠濃度為15％，pH=8.8；濃縮膠濃度為4％，pH=6.8；兩種凝膠均為過硫酸銨(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)系統(tǒng)化學(xué)聚合而成。以0.05％的溴酚藍(lán)作為電泳前沿指示劑。分段控制電壓，開始電泳時電壓為120 V，當(dāng)待測液進(jìn)入分離膠后電壓改為200 V，待溴酚藍(lán)指示劑接近分離膠底部約1 cm時停止電泳。考馬斯亮藍(lán)法測定單頭粉虱成蟲蛋白量，重復(fù)5頭，測定3次。

1．3不同染色方法的比較

電泳結(jié)束后，將同一塊膠縱剖成3塊，分別用以下方法進(jìn)行染色：(1)考馬斯亮藍(lán)染色；(2)海波銀染法染色；(3)考馬斯亮藍(lán)染色后再用海波銀染法染色(復(fù)合銀染法)。其中，考馬斯亮藍(lán)染色法步驟為：取下膠片做好標(biāo)記，在搖床上染色(染色液：0.25 g考馬斯亮藍(lán)G2₂₅₀，100 mL乙醇，25 mL乙酸，用蒸餾水定容至250 mL)約30 min?；厥杖緞?，用蒸餾水沖洗藍(lán)色膠片，再倒入200 mL脫色液(400 mL95％乙醇，100 mL乙酸，用蒸餾水定容至1 000 mL)脫色，如此脫色數(shù)次至蛋白帶顯現(xiàn)。

1．4單頭粉虱可溶性蛋白的圖譜比較

分別取單頭煙粉虱成蟲、溫室白粉虱成蟲可溶性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后利用復(fù)合銀染法進(jìn)行染色，并對染色后的圖譜進(jìn)行比較。

2結(jié)果與分析

2．1不同染色方法效果比較

利用不同的方法對煙粉虱、溫室白粉虱可溶蛋白(分別3.811、6.276 μg)SDS-PAGE染色，結(jié)果見圖1。從電泳圖譜可以看出，用考馬斯亮藍(lán)染色得到的膠片條帶少，且不清晰，背景較深(圖1a)；用海波銀染法染色后得到的條帶比考馬斯亮藍(lán)染色得到的要多，但是底色仍然比較重，影響條帶的清晰度(圖1b)；用復(fù)合銀染法所得條帶多、底色輕、條帶清晰，效果最好(圖1c)。

2．2復(fù)合銀染法在兩種粉虱可溶性蛋白圖譜分析中的應(yīng)用

利用SDS-PAGE技術(shù)對1頭煙粉虱、溫室白粉虱成蟲可溶性蛋白圖譜進(jìn)行比較(圖2)。煙粉虱和溫室白粉虱在蛋白質(zhì)遷移率(Rf)為0.355和0.383位置分別有一條明顯的特征性蛋白帶，可作為區(qū)分兩物種的依據(jù)。

3結(jié)論與討論

考馬斯亮藍(lán)染色法和銀染色法是蛋白質(zhì)凝膠電泳兩種最主要的染色方法。考馬斯亮藍(lán)染色法靈敏度較低，銀染色法比考馬斯亮藍(lán)染色法的靈敏度約高出100倍，但在應(yīng)用中顯色太快，穩(wěn)定性和重復(fù)性較差。近年來，海波銀染法在昆蟲家蠅幼蟲蛋白電泳中不僅效果較好，而且簡便快速。本研究將該方法融入了傳統(tǒng)的復(fù)合銀染技術(shù)中，不僅具有傳統(tǒng)復(fù)合銀染技術(shù)的高靈敏度特點，而且具有簡單快速的特點。利用這種方法，1頭煙粉虱的1／2溶液(約1.900 μg)也可染出清晰圖譜。因此，本研究中的試驗方法，可能在小型昆蟲的蛋白電泳圖譜分析中具有較高的應(yīng)用價值。