高濃度ＣＯ_２氣調脅迫對藥材甲老熟幼蟲磷酸酯酶活力的影響

李　燦　李子忠　鄭興旺　周　波　曹　宇

摘要：用高濃度CO₂氣體脅迫處理藥材甲老熟幼蟲及體外磷酸酯酶，通過終點法測定酶活性變化，分析氣調脅迫與磷酸酯酶活性變化之間的關系。結果顯示，高濃度CO₂密閉處理藥材甲老熟幼蟲6 h和12 h，ACP比活力分別升高6.41％和18.96％，ALP活力分別降低了7.69％和7.91％。ACP經(jīng)CO₂體外處理30、60、120 min，比活力分別增強92.77％、127.43％和67.91％。可見，高濃度CO₂氣調脅迫處理對藥材甲老熟幼蟲ACP和ALP活力均有一定影響。

關鍵詞：藥材甲；高濃度CO₂氣調；磷酸酯酶；比活力

中圖分類號：Q 965．9

儲藏產(chǎn)品，尤其是直接供人畜食用或藥用的產(chǎn)品害蟲防治策略與大田農(nóng)業(yè)害蟲防治策略有根本的區(qū)別，前者對農(nóng)藥殘留問題更為重視。藥材甲[Stegobium paniceum(L.)]隸屬于鞘翅目(Coleop-tera)竊蠹科(Anobiidae)，是一種典型的世界性分布儲藏物甲蟲，近年在貴陽地區(qū)發(fā)生和為害猖獗，藥業(yè)損失嚴重。該蟲是最常見的中藥材儲藏期害蟲之一，已有研究證明利用高濃度CO₂和低濃度O₂協(xié)同作用來控制儲藏物害蟲安全可行、健康環(huán)保，作者嘗試了高濃度CO₂氣調在中藥材害蟲防治中的應用，開展了藥材甲氣調毒理學的基礎研究。

酯酶性質的研究一向是昆蟲毒理學研究的主要內(nèi)容之一，磷酸酯酶因其在昆蟲抗藥性發(fā)展中的作用也受到許多關注。磷酸酯酶有酸性磷酸酯酶(acid phosphatases，ACP)和堿性磷酸酯酶(alkalinephosphatases，ALP)兩類，分別在相應的酸堿性條件下，能夠水解對硝基苯基磷酸二鈉產(chǎn)生黃色物質對硝基苯酚。生物組織損傷會影響到ACP所在腸道的正常生理平衡，進而影響到該酶的活性，導致機體中毒。有機磷和擬除蟲菊酯類以及其他外源性有毒物質均能引起該酶活性的變化。顏增光等的研究表明，高濃度的光活化毒素a-三噻吩(a-ter-thienyl，a-T)對棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)和亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)的ACP和ALP離體活性均有抑制作用。Nathan等的研究表明，印楝素和核多角體病毒(Nucleopolyhedrovirus)能夠抑制斜紋夜蛾(Spodoptera litura)中腸的兩種磷酸酯酶的活性，檸檬苦素(limonoids)對稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis)幼蟲和蛹期的ALP和ACP具有相同的作用。

本研究將CO₂作為外源毒物，通過高濃度脅迫處理藥材甲老熟幼蟲，比較研究氣調處理前后磷酸酯酶活性的變化，以期為氣調殺蟲機理的研究以及昆蟲抗氣性治理提供基礎資料。

1材料與方法

1．1供試蟲源

藥材甲于2002年采自貴陽市藥材公司，在人工氣候實驗室(29±1)℃、相對濕度(75±5)％、光照14h條件下飼養(yǎng)，以中藥材狼毒(Radix euphorbiae Fis-cherianae，購自貴陽市藥材公司)為食料。試驗時已人工飼養(yǎng)15代以上，以3～4齡老熟幼蟲作為試蟲。

1．2主要化學試劑及儀器設備

對硝基苯基磷酸二鈉(Merck)和對硝基苯酚為天津光復精細化工研究所產(chǎn)品，巴比妥鈉為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品，考馬斯亮藍G-250為sigma產(chǎn)品，牛血清白蛋白為Roche產(chǎn)品；酶標儀(Tecan產(chǎn))；高速冰凍離心機(sigma產(chǎn))。

1．3生物測定與昆蟲氣調處理

同齡老熟幼蟲60頭置于20 cm×30 cm×20 cm可充氣密閉塑料培養(yǎng)盒中，用氣體混配儀(長沙長錦科技有限公司產(chǎn))通人CO₂和空氣的混合氣體，CO₂占75％，空氣占25％(體積比)，分別處理6～54 h，相同環(huán)境條件下空氣處理作為對照。死亡標準確定：處理昆蟲移出氣調環(huán)境，室溫條件恢復6 h后，以毛刷子刺激不動視為死亡。試驗重復3次。

1．4酶液提取與制備

本研究分別進行了高濃度CO₂處理幼蟲后提取酶液和對未處理過的昆蟲提取酶液進行體外處理兩類試驗。前者酶液提取方法為：取老熟幼蟲30頭，置于20 cm×30 cm×20 cm密閉培養(yǎng)盒中，通入高濃度CO₂氣體分別處理o h(置于空氣環(huán)境中，作為對照處理)、6 h和12 h(根據(jù)生物測定結果，處理時間內(nèi)死亡率在10％以下)，轉入玻璃勻漿器，加入預冷處理的pH 4.6，0.2 mol／L醋酸緩沖液0.4 mL，冰液充分勻漿，后加入7.6 mL相同緩沖液混勻，分裝于8支1.5 mL離心管，于10 000 r／min，4℃離心15 min，取上清液于4℃冰箱中保存，24 h內(nèi)使用。體外處理試驗則將未經(jīng)CO₂處理的昆蟲，直接如上述方法提取酶液，活性測定試驗前，酶液用高濃度CO₂進行體外處理。

堿性磷酸酯酶ALP的提取方法同ACP提取，將緩沖液改為pH 9.6，0.04 mol／L巴比妥鈉一鹽酸緩沖液即可。

1．5酶液體外處理

將未處理幼蟲直接提取的酶液混勻分裝于4支相同的試管中，置于37℃恒溫水浴，持續(xù)通入高濃度CO₂氣體，流速100mL／min，分別處理30、60、120 min時測定酶活性，取等量酶液不通氣置于相同水浴溫度條件下，靜置對應時間作對照處理。

1．6制作標準曲線

用去離子水配制7.5 mmol／L對硝基苯酚標準溶液，于8支5 mL試管中分別加入標準溶液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL，用0.2 m01／L醋酸緩沖液配平至3.0 mL，于37℃水浴靜置30 min后取出，加入0.2 mol／L氫氧化鈉溶液2.0 mL，室溫靜置10 min后于400 nm處測OD值。以對硝基苯酚濃度為自變量(x)，其在400 nm處的OD值為因變量(y)，回歸制作標準曲線，得標準物質對硝基苯酚在酸性條件下的標準曲線。

如上方法，將緩沖液換為0.04 mol／L巴比妥鈉一鹽酸緩沖液，氫氧化鈉濃度調整為0.1 mol／L，制作對硝基苯酚在堿性條件下的標準曲線。同樣，配制牛血清白蛋白標準溶液，設定不同濃度于595 nm處測定OD值，以牛血清白蛋白濃度作自變量(x)，其在595 nm處的吸光度值為因變量(y)，得到標準

曲線。

1．7酶活性測定和數(shù)據(jù)處理

參照Bradford等的方法，用考馬斯亮藍G-250法測定酶源蛋白含量，以牛血清白蛋白制作標準曲線。參照Bessey的方法，用對硝基苯酚制作標準曲線。底物對硝基苯基磷酸二鈉在磷酸酯酶的作用下，水解生成對硝基苯酚，在堿性條件下呈黃色，于400 nm波長處比色測定OD值。酶活性測定反應體系中含5×10^-4mol／L對硝基苯基磷酸二鈉0.5 mL，酶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，反應總體積用0.2 mol／L醋酸緩沖液配平至3.0 mL，混合液于37℃恒溫水浴反應30 min后，立即加入0.2 mol／L氫氧化鈉2.0 mL終止反應(測定ALP活性時將氫氧化鈉濃度換為0.1 mol／L，緩沖液換為0.04 mol／L巴比妥鈉－鹽酸緩沖液)，室溫靜置10 min，于400nm處測定OD值。

根據(jù)標準曲線和酶源蛋白含量的測定結果，將酶液用量(mL)轉換成酶液蛋白含量(mg)，將酶活性測定結果的OD值換算為相當于標準物質對硝基苯酚的量(μmol)，然后以蛋白質含量(mg)為橫坐標，對硝基苯酚的量(μmol)為縱坐標，進行回歸制作活力曲線，該曲線的斜率即為相應ACP或ALP的比活力μmol／mg·(30 min)^-1。

2結果與分析

2．1生物測定

藥材甲老熟幼蟲經(jīng)高濃度CO₂處理后，死亡率曲線如圖1所示。處理18 h內(nèi)，藥材甲幼蟲死亡率均很低，多數(shù)處于昏迷狀態(tài)，移出處理環(huán)境6 h可復活，屬于“擊倒”不記人死亡。處理30 h時，平均死亡率升高至50％。經(jīng)回歸分析(SPSS 11.5，Probit Analysis)，半數(shù)死亡時間LT₅₀為30.022 h，95％置信限為28.588～31.426 h。可見，如果需要通過高濃度CO₂氣調處理來殺滅藥材甲幼蟲，全面密閉處理48 h是必要的。實踐中還應考慮藥材甲幼蟲蛀食于藥材內(nèi)部為害的特點，因此，處理時間應超過48 h。

2．2標準曲線應用

對硝基苯酚在酸／堿性條件下的標準曲線分別為：y_a=11.624 x+0.004，R²=0.999 3^**；yb=11.377 x+0.002，R²=0.998^**。牛血清蛋白標準曲線為：y=0.018 6 x+0.026，R²=0.998^**，用作酶源蛋白含量定量測定標準。以上3個標準曲線線性關系均極顯著。

2．3藥材甲老熟幼蟲高濃度CO₂脅迫下磷酸酯酶比活力

藥材甲老熟幼蟲經(jīng)高濃度CO₂密閉處理6 h和12 h，其磷酸酯酶活力曲線如表1所示。曲線斜率即為相應處理下的磷酸酯酶比活力。老熟幼蟲在高濃度CO₂環(huán)境中密閉處理6 h和12 h，其ACP比活力分別升高6.41％和18.96％，而ALP活力則分別降低了7.69％和7.91％。

2．4藥材甲老熟幼蟲ACP酶液體外處理后酶活力

未經(jīng)高濃度CO₂處理之藥材甲老熟幼蟲提取ACP，酶液經(jīng)體外持續(xù)通入高濃度CO₂氣體處理30、60、120 min，其活力曲線如表2所示。曲線的回歸方程斜率即為相應處理下的ACP比活力。高濃度CO₂體外處理30、60、120 min，比活力分別增強92.77％、127.43％和67.91％?？梢?，藥材甲老熟幼蟲ACP在高濃度CO₂體外處理下，其比活力有不同程度的升高。

3結論與討論

磷酸酯酶性質的改變是導致昆蟲對有機磷類等農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的原因之一，昆蟲可以通過磷酸酯酶活性的增強來提高對外源性毒物的解毒能力，這種能力最終發(fā)展為抗性，昆蟲對氣調處理產(chǎn)生抗性與若干酶的活性變化有關。過去人們對CO₂氣調處理對昆蟲作用的研究，主要集中于通過CO₂與其他氣體的配比設計來提高對昆蟲的殺傷效果，很少有研究關注CO₂氣調處理對昆蟲生理生化活動的影響，目前還沒有發(fā)現(xiàn)有關CO₂氣調處理對藥材甲磷酸酯酶活力影響的正式報道。本研究中高濃度CO₂氣調處理藥材甲老熟幼蟲可導致其磷酸酯酶活力的變化，高濃度CO₂氣體作用于藥材甲老熟幼蟲機體，其體內(nèi)的ACP活性增強，ALP活性稍微受到抑制，高濃度CO₂對ALP和ACP活性作用不一致，可能與CO₂進入蟲體內(nèi)富集后，改變了體液的酸堿性平衡有關，因pH降低，致使堿性磷酸酯酶活力受到抑制。

藥材甲老熟幼蟲未經(jīng)CO₂處理提取ACP，酶液經(jīng)高濃度CO₂體外處理30～120 min，其比活力均顯著升高，這個結果與高濃度CO₂直接處理藥材甲幼蟲相似，其差異在于體外處理的作用更明顯，說明CO₂對藥材甲幼蟲ACP確有激活作用。這一結果與其他已知的外源性毒物如a-T等對昆蟲作用的方式不一致，a-T的作用抑制了ACP和ALP的活性，而高濃度CO₂作用雖然對ALP有輕微的抑制作用，但卻激活了ACP的解毒能力，可見，高濃度CO₂氣調的殺蟲與a-T的作用機理可能是不同的。這一結果的發(fā)現(xiàn)，對于認識氣調作用對儲藏物害蟲控制的作用機理有積極意義。