廣東省辣椒疫霉菌嘧菌酯的敏感性

姜彥全　王振中

摘要：從廣東省各地采集了54個(gè)辣椒疫霉菌株，分別測定了菌絲生長和游動孢子囊形成對嘧菌酯的敏感性。結(jié)果表明，嘧菌酯對辣椒疫霉的菌絲生長具有很強(qiáng)的抑制作用，EC₅₀范圍為0.142 8～1.950 9 μg／mL，平均為0.964 9 μg／mL；對游動孢子囊形成的抑制作用更強(qiáng)，EC₅₀范圍為0.001 0～0.084 4 μg／mL平均為0.023 9 μg／mL。正態(tài)分析表明，辣椒疫病菌54個(gè)菌株菌絲生長對嘧菌酯的敏感性符合正態(tài)分布，而孢子萌發(fā)則在高濃度區(qū)具有拖尾現(xiàn)象，表明自然界中已存在個(gè)別具有一定耐藥性的辣椒疫霉種群。

關(guān)鍵詞：辣椒疫霉；嘧菌酯；抗藥性

中圖分類號：S，182．2

辣椒疫病是由辣椒疫霉(Phytohpthora capsici)引起的一種毀滅性土傳病害。在世界各地的辣椒種植區(qū)普遍發(fā)生，我國各辣椒產(chǎn)區(qū)疫病大量發(fā)生，嚴(yán)重影響了辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)。辣椒疫霉除了侵染辣椒以外，還可以侵染番茄、茄子、黃瓜、甜瓜、西瓜、南瓜等，病菌侵染后潛育期短，發(fā)病快，因而辣椒疫病防治十分困難。目前，防治辣椒疫病主要用化學(xué)防治方法，由于辣椒疫霉菌極易對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，化學(xué)防治的效果常常因?yàn)椴【顾幮缘奶岣叨蟠蠼档汀?/p>

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑(strobilurins)是以天然產(chǎn)物strobilurin A為先導(dǎo)化合物開發(fā)而來的一類仿生合成殺菌劑，是繼苯并咪唑類后的一類新穎殺菌劑。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是一種廣譜殺菌劑，能有效地防治卵菌、接合菌、子囊菌、擔(dān)子菌和半知菌等真菌引起的病害。1992年11月第一個(gè)甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑新產(chǎn)品嘧菌酯(azoxystrobin)誕生，至2001年已在70個(gè)國家80多種作物上登記。嘧菌酯于2001年在我國登記，至今，strobilurins作為殺菌劑專利共有近30家公司，產(chǎn)品近500個(gè)。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑作用于真菌線粒體電子傳遞鏈的復(fù)合物Ⅲ，阻斷電子傳遞，干擾能量合成。由于其作用機(jī)制新穎，與苯基酰胺類殺菌劑無交互抗藥性，目前被廣泛使用。但已有研究表明某些病原菌靶標(biāo)對該類藥劑產(chǎn)生抗藥性自發(fā)突變頻率較高。目前甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑剛開始應(yīng)用于辣椒疫霉菌的防治，分析研究其抗藥性現(xiàn)狀和抗藥性產(chǎn)生的可能性，具有重要的實(shí)踐意義。

1材料與方法

1．1病原菌的分離與純化

在無菌操作條件下，將辣椒感病組織，切成0.5 cm見方的小塊，用75％的乙醇對上述小塊病組織表面消毒后，用已滅好菌的濾紙、保濕紙和硬紙依次由內(nèi)到外包好，然后放在d=9 cm鋪有濾紙和保濕紙的培養(yǎng)肌中，每皿放3塊，在25℃下培養(yǎng)7～15 d，其中每隔3天觀察1次并保持病組織塊的濕潤狀態(tài)。選取白色霉?fàn)钗锏牟〗M織塊，再按照常規(guī)方法用次氯酸鈉溶液滅菌1 min后，放于選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

按鄭小波的方法，將盛有大量孢子囊的培養(yǎng)皿放入4℃冰箱中10～15 min后，取出置于25℃下30 min，低倍鏡下可見大量游動孢子釋放．用滅菌吸管吸取孢子懸浮液1～4滴(視孢子濃度而定)涂布于含青霉素、利福平、五氯硝基苯各50 μg／mL的10％V8汁水瓊脂平板上，置25℃黑暗培養(yǎng)8～12 h。取出培養(yǎng)皿置于顯微鏡下觀察；切取帶有單個(gè)已萌發(fā)游動孢子的瓊脂塊置于選擇性培養(yǎng)基(含青霉素、利福平、五氯硝基苯各50 μg／mL的LBA培養(yǎng)基(利馬豆60 g加水1 000 mL，充分煮沸，4層紗布過濾去渣，濾液補(bǔ)足水至1 000 mL，加入瓊脂20 g)平板上，在25℃黑暗中培養(yǎng)2～3 d，可獲得純凈的單游動孢子無性系。

1．2辣椒疫霉菌絲生長對嘧菌酯的敏感性測定

本試驗(yàn)所用的嘧菌酯由先正達(dá)公司贈送，為98％原藥。原藥先用V(甲醇)：V(丙酮)=1：3配制成濃度為100 μg／mL的母液備用。

將疫霉菌接種于LBA培養(yǎng)基平板上，25℃下黑暗培養(yǎng)5 d，用直徑4 mm的打孔器在近菌落邊緣1／3處打孔，制成接種菌絲圓碟。取適量的嘧菌酯母液，加入溶化后冷卻到50℃左右的LBA培養(yǎng)基中，混勻，制成0、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 μg／mL梯度濃度的LBA平板。待培養(yǎng)基冷卻后用接種針挑取菌碟，菌面向下接于含毒培養(yǎng)基中心，每皿1塊。放入恒溫箱中，25℃下培養(yǎng)5 d用十字交叉法測量菌落直徑，每處理4皿，試驗(yàn)重復(fù)3次。

測量菌落直徑，依下式計(jì)算不同濃度藥劑對疫霉菌菌絲生長抑制率：

計(jì)算抑制率幾率值和濃度對數(shù)值的毒力方程，毒力公式計(jì)算嘧菌酯對疫霉菌各菌株的抑制中濃度EC₅₀及相關(guān)系數(shù)r值。數(shù)值統(tǒng)計(jì)計(jì)算用SAS程序進(jìn)行。

對54個(gè)菌株的EC₅₀進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，確定是否符合正態(tài)分布。正態(tài)分布檢驗(yàn)用SAS程序進(jìn)行。

1．3辣椒疫霉游動孢子囊形成對嘧菌酯的敏感性測定

參照Matheron等的方法，從生長在LBA平板上的疫霉菌落邊緣1／3處打直徑為5 mm的菌碟4塊，置于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，加入含有0、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 μg／mL嘧菌酯的無菌水5 mL，使得液面剛剛沒過菌絲塊，24℃下光暗交替(12 h∥12 h)培養(yǎng)3 d后，倒去無菌水，在菌碟上滴加少許酸性品紅，10～15 s后滴加乳酸直至洗去大量品紅。游動孢子囊呈現(xiàn)紅色，在菌碟上隨機(jī)挑取3個(gè)視野，在顯微鏡下對游動孢子囊進(jìn)行計(jì)數(shù)，每處理4皿，試驗(yàn)重復(fù)3次。

同菌絲生長抑制試驗(yàn)，計(jì)算54個(gè)菌株的EC₅₀，并進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2．1辣椒疫霉菌的分離

從廣東省廣州番禺、韶關(guān)始興、陽江陽西、湛江雷州、茂名信宜以及惠州博羅等辣椒疫霉病經(jīng)常發(fā)生的地區(qū)采集的辣椒疫病樣本，經(jīng)分離、純化和鑒定后，確認(rèn)得到了54個(gè)辣椒疫霉菌菌株(表1)。

2．2辣椒疫霉菌對嘧菌酯的敏感性水平測定

2．2．1辣椒疫霉病菌菌絲生長對嘧菌酯的敏感性

對單孢分離得到的54個(gè)單孢菌株，采用菌絲生長速率法測定各菌株的EC₅₀(表1)。

54個(gè)辣椒疫霉病菌菌株對嘧菌酯敏感性測定的結(jié)果表明，病菌群體對嘧菌酯敏感性表現(xiàn)沒有太大差異，如EC₅₀最高為湛江雷州的LZ9，EC₅₀為1.950 9 μg／mL，而惠州的HZl菌株EC₅₀最低，只有0.142 8 μg／mL，供試54個(gè)菌株的平均EC₅₀。為0.964 9 μg／mL。

在疫霉菌對藥劑的敏感性變化范圍內(nèi)，將EC₅₀

等分為16個(gè)階段，統(tǒng)計(jì)每個(gè)階段菌株的個(gè)數(shù)和頻率，然后以每個(gè)階段EC₅₀的中值為橫坐標(biāo)，頻率為縱坐標(biāo)，作出頻率分布圖(圖1)，圖中的峰代表病原菌群體對藥劑的敏感性分布；同時(shí)，采用sPsS敏感性分布進(jìn)行了K-S正態(tài)性檢驗(yàn)，得Z=0.711 4，P=0.692 0，EC₅₀表現(xiàn)連續(xù)性，則說明這54個(gè)菌株對嘧菌酯不同敏感性菌株的頻率分布符合正態(tài)分布，辣椒疫霉自然種群對嘧菌酯沒有明顯的抗藥性。

因此對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑而言，病菌群體基本還處于原始種群，故此試驗(yàn)測定得到的54個(gè)菌株對嘧菌酯的平均EC₅₀0.964 9 μg／mL，可作為辣椒疫霉菌對嘧菌酯的敏感性基線。

2．2．2辣椒疫霉病菌游動孢子囊形成對嘧菌酯的敏感性

嘧菌酯對54個(gè)辣椒疫霉病菌游動孢子囊形成的EC₅₀為0.001 0～0.084 4 μg／mL(表2)，平均EC₅₀為0.023 9 μg／mL。嘧菌酯濃度為0.05 μg／mL時(shí)，對敏感菌株孢子囊形成的抑制率達(dá)89.4％，說明嘧菌酯對辣椒疫霉游動孢子囊形成有強(qiáng)烈的抑制作用，比對疫霉菌菌絲的活性高40.4倍。

采用SPSS敏感性分布進(jìn)行了K-s正態(tài)性檢驗(yàn)，得z=1.671，p=0.007 5，游動孢子囊對嘧菌酯的敏感性沒有呈現(xiàn)正態(tài)分布的規(guī)律(圖2)，部分菌株EC₅₀頻率分布有拖尾現(xiàn)象。這表明，在自然種群中，有部分自發(fā)突變的菌株有一定的耐藥性。

3結(jié)論與討論

在廣東省不同地區(qū)采集分離了54個(gè)辣椒疫霉病菌菌株，對這54個(gè)菌株進(jìn)行嘧菌酯的敏感性測定表明，廣東省辣椒疫病菌的菌絲生長和孢子囊形成對嘧菌酯均具有較高的敏感性。54個(gè)菌株菌絲生長的敏感性符合正態(tài)分布，菌株間的EC₅₀分布連續(xù)，但部分菌株孢子囊形成對嘧菌酯有一定程度的耐藥性，EC₅₀具有拖尾現(xiàn)象。

辣椒疫病在發(fā)病初期田間易形成發(fā)病中心，病部在高濕條件下可形成大量游動孢子囊，并釋放游動孢子。游動孢子囊和游動孢子均可成為再侵染源，侵染健康植株。試驗(yàn)結(jié)果表明，嘧菌酯對辣椒疫霉菌絲生長的抑制效果低于其對游動孢子囊的抑制效果。因此，在發(fā)病初期使用較低濃度的嘧菌酯可有效地抑制發(fā)病中心游動孢子囊的形成，從而對游動孢子囊及游動孢子的萌發(fā)起抑制作用，可以有效地抑制病原菌的再侵染，對病害的傳播和流行起到很好的控制作用。以有效中濃度(EC₅₀)為參數(shù)，嘧菌酯抑制菌絲生長的活性比抑制孢子囊形成要低25.3倍，說明了嘧菌酯對菌絲生長的抑制活性較低，對已發(fā)病的寄主治療效果較差。建議在防治辣椒疫病時(shí)應(yīng)在發(fā)病初期，病原菌剛侵入寄主之時(shí)施藥。對辣椒疫霉病的防治宜采取嘧菌酯與多位點(diǎn)保護(hù)性殺菌劑混用或輪用的措施，以緩解內(nèi)吸性殺菌劑對抗藥性的選擇壓力，延長藥劑的使用壽命。

當(dāng)某一殺菌劑使用之前，病原群體中就有極少數(shù)菌株對此殺菌劑表現(xiàn)抗性，只是頻率很小。產(chǎn)生抗性的原因可能是：對單一作用位點(diǎn)的殺菌劑，病原菌只要發(fā)生單基因或少數(shù)寡基因的突變就可以導(dǎo)致病原物靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)的改變，而降低對?；运巹┑挠H和性，某些生理生化代謝也可以發(fā)生某種變化，修飾細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)或生物膜的結(jié)構(gòu)，阻止藥劑到達(dá)作用靶標(biāo)，或者減少對藥劑的吸收，或者增加排泄，減少藥劑在細(xì)胞內(nèi)的積累等而表現(xiàn)抗藥性。在測定辣椒疫霉菌游動孢子囊形成對嘧菌酯的敏感性時(shí)，發(fā)現(xiàn)EC₅₀頻率分布沒有呈現(xiàn)正態(tài)分布，而是有拖尾現(xiàn)象，可能主要是由菌株本身具有較低的抗性的結(jié)果。因?yàn)榫鸵呙咕旧韥碚f，它是易產(chǎn)生突變的物種。