煙草赤星病菌菌種保存及致病性研究

易　龍

摘要：在煙草赤星病抗性鑒定和生防菌劑篩選工作中，常因菌種在室內(nèi)連續(xù)多代移植培養(yǎng)導(dǎo)致菌株的致病力衰弱，而影響測定結(jié)果的準確性和一致性。對此，本研究嘗試將赤星病菌種經(jīng)Richards培養(yǎng)液制備成菌層，置于4℃低溫環(huán)境條件下長期保存，連續(xù)5年測定其培養(yǎng)性狀和致病力，與連續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)方法保存的菌種進行比較，結(jié)果表明在連續(xù)5年的試驗過程中，Richards法保存的菌種在培養(yǎng)性狀和致病性上沒有發(fā)生衰退，該菌種保存方法制作簡單、經(jīng)濟、可靠，適用于煙草品種抗赤星病鑒定和生防菌劑的篩選工作。

關(guān)鍵詞：煙草赤星病菌；菌種保存；致病性

中圖分類號：S 435．72

煙草赤星病是煙葉成熟后期重要的葉部真菌性病害，是煙草生產(chǎn)上威脅最大的病害之一。該病具有潛育期短、流行速度快的特點，在環(huán)境條件適宜的情況下，短時間內(nèi)即可造成大流行，給煙葉生產(chǎn)帶來巨大損失。自1892年首次報道煙草赤星病以來，曾幾次給世界煙葉生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失。我國1916年首次在北京附近發(fā)現(xiàn)，1964年山東煙區(qū)大流行，損失很大，隨后此病在全國各煙區(qū)日趨嚴重。1989-1991年，河南省平均每年因赤星病造成煙草損失達2 300萬元，成為毀滅性的病害。2000年8月美國康涅狄格州和馬塞諸塞州，煙草赤星病大暴發(fā)，兩州煙草減產(chǎn)75％和89％。目前對赤星病主要靠化學(xué)藥劑進行治理，隨之帶來的農(nóng)藥殘留、病原菌抗藥性以及影響卷煙衛(wèi)生等問題，限制了農(nóng)藥的大規(guī)模應(yīng)用。生產(chǎn)實踐證明，選育種植抗病品種和篩選生防菌劑是控制赤星病經(jīng)濟、安全、有效的途徑。

鑒定煙草品種對赤星病抗性以及篩選菌劑都應(yīng)選擇可用于人工接種的代表性菌株。由于煙草赤星病菌菌株問的致病力存在分化現(xiàn)象，故在對煙草赤星病進行試驗中，一般選用致病性較強，且穩(wěn)定一致的病原菌，常規(guī)菌種保存方法——連續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)，因頻繁繼代培養(yǎng)，常導(dǎo)致菌株致病力逐漸衰弱，而直接影響抗病性鑒定結(jié)果和生防菌劑篩選的準確性與一致性。

本試驗旨在通過由Richards法制備在低溫條件下保存的煙草赤星病菌菌層，對其培養(yǎng)性狀和致病力進行觀察和測定，尋求一種簡單、經(jīng)濟、可靠的赤星病菌種制作保存方法，有利于煙草赤星病抗病育種和生防菌劑篩選工作的有效開展。

1材料和方法

1．1供試材料

1．1．1供試菌株

煙草赤星病菌菌株Tbs3于2001年在重慶煙區(qū)采集的典型病斑上單孢分離獲得，經(jīng)鑒定具有較強致病力。

1．1．2供試煙草品種

烤煙品種K326，種子由云南省煙草科學(xué)研究所提供，幼苗在溫室培育至15～16片真葉。

1．2試驗方法

1．2．1赤星病菌種制作

用1％硝酸鉀、0.5％磷酸二氫鉀、0.25％硫酸鎂(MgSO₄·7H₂O)、5％蔗糖、0.02‰氯化鐵組成的Richards培養(yǎng)液進行赤星病菌的靜置培養(yǎng)，10 d后培養(yǎng)觀察性狀，用無菌水洗凈附著在菌層上的營養(yǎng)物質(zhì)后平攤在濾紙上，無菌條件下放置24 h，陰涼保存。

1．2．2赤星病菌菌株培養(yǎng)性狀觀察

2002-2006每年10月份，將上述保存的菌種(命名為Tbs3-R)同常規(guī)每隔3個月連續(xù)轉(zhuǎn)代保存于PDA斜面上的菌種(命名為Tbs3-c)轉(zhuǎn)接于PDA平板上，置于26℃恒溫培養(yǎng)，將菌種活化后分別挑取直徑5 mm大小的菌塊轉(zhuǎn)到PDA平板中央，置于26℃恒溫箱中培養(yǎng)，于3、5、7 d后測量菌落的增長直徑，每菌株設(shè)5個重復(fù)，每重復(fù)為一皿。待皿內(nèi)菌絲長滿以后，觀察菌絲的色澤變化。同時取赤星病菌孢子用無菌水配制為2.5×10⁵個／mL孢子懸浮液，26℃培養(yǎng)，6、12、24 h后鏡檢其孢子的萌發(fā)，以芽管長度超過分生孢子小端直徑1／2時記錄為萌發(fā)，每處理重復(fù)3次，計算孢子萌發(fā)率。

1．2．3兩種方法保存菌株的致病力比較

將兩種方法保存的菌株Tbs3-R、Tbs3-C進一步在溫室盆栽條件下測定對煙草的致病性，將各菌株培養(yǎng)7 d后，用1％無菌葡萄糖溶液配制成2.5×10⁵個／mL孢子懸浮液，每菌株重復(fù)3次，每重復(fù)處理5株幼苗，每株接種第4～6片真葉，每葉接種12滴，每滴25 μL，接種后26℃保濕培養(yǎng)5 d，以無菌水處理為對照。

統(tǒng)計各菌株的葉片接種位點發(fā)病率、發(fā)病嚴重度和病情指數(shù)，結(jié)果用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計分析。發(fā)病嚴重度分級標準及病菌致病力強弱分化標準見表1。

2結(jié)果與分析

2．1赤星病菌種制作結(jié)果

菌種經(jīng)靜置培養(yǎng)10 d后在液體表面形成茶色或棕色菌層，用無菌水洗凈附著在菌層上的營養(yǎng)物后平攤在濾紙上放置24 h，可形成許多暗綠色的分生孢子，于4℃條件下陰涼保存。

2．2兩種方法保存菌種的孢子萌發(fā)和菌落生長

兩種方法保存的菌種孢子萌發(fā)率及菌絲生長率見表2。從2001年通過單孢分離獲得的赤星病菌菌種連續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)的菌株Tbs3-C，以及由Richards法培養(yǎng)的菌層低溫保存的菌種Tbs3-R，經(jīng)連續(xù)5年的檢測發(fā)現(xiàn)，Tbs3-C同Tbs3-R相比，菌種在保存兩年后孢子萌發(fā)率有顯著降低，同時菌絲生長緩慢，菌落多呈不規(guī)則形、色澤不均，而Richards法制作的菌層保存的菌種Tbs3-R并無明顯變化，孢子萌發(fā)和菌絲生長正常，菌落呈近圓形、墨綠色。

2．3兩種保存方法菌種的致病力比較

試驗結(jié)果表明，在連續(xù)5年的致病力測定中，轉(zhuǎn)代培養(yǎng)的菌種Tbs3-C致病力變化最為明顯，在保存時間兩年內(nèi)(2002、2003年)的檢測中，致病力變化不大，菌株致病力仍然較強，而在保存3～4年(2004、2005年)的菌株接種位點發(fā)病率逐漸降低，致病力已發(fā)生明顯的衰退，與前期菌種在致病力上已存在明顯的差異，連續(xù)保存至第五年(2006年)，菌株致病力急劇衰弱，而Richards法菌層保存的菌種Tbs3 R在致病力等方面無明顯變化，結(jié)果見表3。

從上述結(jié)果可以看出，菌層保存的菌種未經(jīng)任何轉(zhuǎn)代，一直保存于4℃低溫條件下，每次試驗取少量菌種活化進行試驗，在連續(xù)5年(5次)的測試過程中，Richards法保存的菌種Tbs3-R比常規(guī)PDA斜面連續(xù)轉(zhuǎn)代保存的菌種Tbs3-C致病力強，導(dǎo)致Tbs3-C生長勢及孢子萌發(fā)率降低原因可能在PDA試管保存過程中經(jīng)過連續(xù)轉(zhuǎn)代后，其生長等方面衰變，同時致病力降低。

3討論

通過對Richards和常規(guī)菌種連續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)兩種方法保存的菌株培養(yǎng)性狀和致病力測定表明：由Richards法保存的煙草赤星病菌菌種Tbs3-R在4℃條件下能夠長時間保存，其致病力沒有發(fā)生衰退。這種制作保存方法較之常用的PDA斜面試管保存法更為經(jīng)濟簡單、省事省時，不需要特殊設(shè)備，只要把液體培養(yǎng)過程中得到的菌層晾干，放在陰涼處，即可長期保存，又可按試驗要求隨時制取具有強病原性的新鮮孢子，可為煙草赤星病鑒定選擇提供致病力穩(wěn)定的菌株，從而保證年際間抗性鑒定結(jié)果的可比性、一致性和可靠性。

由常規(guī)連續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)的菌種Tbs3-C在室內(nèi)培養(yǎng)過程中，菌絲生長發(fā)育、孢子萌發(fā)率較Tbs3-R緩慢，室內(nèi)接種葉片致病力有所減弱，在PDA試管保存過程中，經(jīng)多次轉(zhuǎn)管后容易發(fā)生變異，同時菌絲生長易于老化，產(chǎn)毒素能力降低，可能是造成致病力降低的原因之一，該菌株其他生理生化變異需進一步深入研究。

煙草赤星病菌是一類弱寄生菌，為煙草成熟后期重要病原真菌，而新葉對其幾乎是免疫的，所以寄主品種的抗病性鑒定和室內(nèi)生防菌劑的篩選都應(yīng)采用致病力較強的菌株，本試驗還檢測出煙草赤星病菌在常規(guī)PDA斜面上的保存時間大概為兩年左右，超過上述期限，菌株的致病力將明顯衰退，而Richards法可為實際應(yīng)用提供至少在5年內(nèi)致病力保存方法能否推廣應(yīng)用到其他真菌的保存以及用此種方法可以保存的最長年限，尚待進一步研究證實。