煙蚜繭蜂畸形細(xì)胞發(fā)生及發(fā)育

劉金文　李建平　叢　　斌　李茂?！罟鹑A　侯云龍　曲文莉

摘要：煙蚜繭蜂(Aphidius gifuensis)畸形細(xì)胞來(lái)源于卵的漿膜層。蜂產(chǎn)卵33～36 h后幼蟲(chóng)孵化，每胚胎平均釋放150個(gè)細(xì)胞?；渭?xì)胞的直徑隨寄生日齡而增加，由初始直徑(22.1±6.5)pm增長(zhǎng)到第5天達(dá)最大為(30.1±8.5)μm。但是，其大小受多種因素影響，隨寄主齡期和外界因素等不同而有差異，即使是條件相同其大小也有不同，最小的9.0 pm，最大可達(dá)100.0μm，但其數(shù)目卻隨日齡增長(zhǎng)而下降。掃描電鏡顯示：畸形細(xì)胞表面覆有微絨毛，4日齡比1日齡的更長(zhǎng)、更密，表明吸收和分泌功能增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：煙蚜繭蜂；畸形細(xì)胞；發(fā)生；發(fā)育；超微結(jié)構(gòu)

中圖分類(lèi)號(hào)：S 476．3

煙蚜繭蜂(Aphidius gifuensis)是寄生蔬菜、果樹(shù)、棉花和大田作物上蚜蟲(chóng)的一種寄生蜂。作為一種害蟲(chóng)生物防治的重要因子，在溫室以及大田中，煙蚜繭蜂都起到了很重要的作用。同時(shí)，畸形細(xì)胞對(duì)寄生蜂寄生寄主也起到了重要的調(diào)控作用。以煙蚜繭蜂和煙蚜作為一對(duì)模式體系能夠揭示寄生蜂寄生寄主的內(nèi)部機(jī)理，并對(duì)指導(dǎo)寄生蜂的人工飼養(yǎng)和利用、害蟲(chóng)綜合治理以及探索應(yīng)用生物高科技控制害蟲(chóng)等方面均具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。同時(shí)，為探索寄生蜂與寄主的協(xié)同進(jìn)化作進(jìn)一步的研究。

繭蜂科、廣腹細(xì)蜂科、緣腹卵蜂科的蜂卯孵化時(shí)，起胚胎營(yíng)養(yǎng)作用的漿膜釋放到寄主血淋巴中，分散后游離形成畸形細(xì)胞。分散的畸形細(xì)胞在寄主血腔中發(fā)育方式從數(shù)量、大小、染色體倍性等變化呈現(xiàn)種的特異性。

本文以煙蚜繭蜂和煙蚜為研究體系，觀察了煙蚜繭蜂畸形細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)育過(guò)程以及結(jié)構(gòu)上的變化，這些研究為今后進(jìn)一步探討其生理功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1．1寄主植物

從沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)免疫實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)田中選擇直徑6～7 cm的蘿卜(Raphanus sativus L.)收藏備用。試驗(yàn)前，將蘿卜栽植于塑料(d=14 cm)花盆內(nèi)，待新葉長(zhǎng)至6～7 cm時(shí)放置于溫度為(25±2)℃，相對(duì)濕度為70％～90％，每日光照周期L∥D為14 h∥10 h，光照強(qiáng)度為3 000 lx的人工氣候培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1．2供試?yán)ハx(chóng)

1．2．1煙蚜

煙蚜(Myzus persicae)采自沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒研究室試驗(yàn)田的煙草上，然后接種到上述栽植的蘿卜葉片上，控制每株上的蚜量，連代擴(kuò)繁保種，以備試驗(yàn)。

1．2．2煙蚜繭蜂

從病毒研究室試驗(yàn)田內(nèi)采集自然發(fā)生的僵蚜，在室內(nèi)羽化出蜂，經(jīng)鑒定確認(rèn)后，按雌雄蜂1：1配對(duì)，交配后接種于預(yù)先繁殖有200～300頭煙蚜的盆栽蘿卜植株上，進(jìn)行擴(kuò)繁。

1．3煙蚜繭蜂畸形細(xì)胞在煙蚜體內(nèi)的發(fā)育

1．3．1畸形細(xì)胞測(cè)量

取150頭3～4齡若蚜，后分別轉(zhuǎn)移150個(gè)小型指形管(d=1.0 cm，h=2.5 cm)中，再接入150頭交配的雌蜂，觀察一次產(chǎn)卵寄生行為發(fā)生后，將被寄生的蚜蟲(chóng)全部取出，放到新鮮無(wú)蚜蘿卜上繼續(xù)進(jìn)行喂飼；從被寄生24 h后開(kāi)始，至幼蜂完成在寄主體內(nèi)的發(fā)育，每隔24 h取下20頭蚜蟲(chóng)，經(jīng)電光源解剖鏡(OLYMPUs JM型)，在滴有Ringers生理鹽水的載玻片上解剖，對(duì)不能及時(shí)解剖的蚜蟲(chóng)用FAA液(冰醋酸：甲醛：95％酒精：水分別為1：1：10：7)固定。在每頭寄主的血淋巴中隨機(jī)測(cè)量20個(gè)畸形細(xì)胞的直徑，最后取其平均值。并對(duì)不同日齡畸形細(xì)胞，用倒置相差電光源顯微鏡(OBH型)拍照。畸形細(xì)胞活性由0.1％的中性紅吸收檢測(cè)。

1．3．2畸形細(xì)胞計(jì)數(shù)

在蜂卵孵化前，每隔24 h取出寄主蚜蟲(chóng)20頭，在15×解剖鏡下，從寄主血淋巴中收集15粒卵，接種到含有TC-100Medium(GIBCO公司)的培養(yǎng)皿中，幼蜂孵化后，將其置于震動(dòng)臺(tái)上，低速離心使畸形細(xì)胞從卵殼中完全游離出來(lái)，在顯微鏡下計(jì)數(shù)并計(jì)算每粒卵產(chǎn)生的畸形細(xì)胞的平均數(shù)。然后每隔24 h解剖被寄生的蚜蟲(chóng)，取20頭幼蜂先浸于70％乙醇中，接著用蒸餾水沖洗，并將蜂表面水吸干，每頭幼蜂放在盛有TC-100 Medium的培養(yǎng)皿中解剖，去除寄主血細(xì)胞和其他雜物，用玻璃吸管收集其中的畸形細(xì)胞滴入離心管管中，3 000 r／min(TL-18M型)離心10 min，以1 mL PTU-PBS(8％苯基硫脲溶于磷酸鹽緩沖液0.067 mol／L PBS，pH7.0)沖洗3次，最終在10 mL PBS(0.067mol／LPBS，pH7.0)中懸浮，每10 mL樣品中抽取100 μL，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板觀察計(jì)數(shù)的畸形細(xì)胞的數(shù)量，取5次重復(fù)的均值再擴(kuò)大100倍，即為總的畸形細(xì)胞數(shù)。

1．4煙蚜繭蜂幼蟲(chóng)在寄主體內(nèi)的發(fā)育

從蜂卵產(chǎn)到寄主體內(nèi)24 h后，再每隔24 h解剖蚜蟲(chóng)35頭，測(cè)量35頭幼蜂體長(zhǎng)、體寬，根據(jù)計(jì)算公式V=n／4·LD²／4(V：體積；L：長(zhǎng)度；D：寬度)計(jì)算卵、蛹、幼蟲(chóng)及幼蜂的體積。

1．5畸形細(xì)胞超微形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察

將按1．3．2中的方法收集并粗提的畸形細(xì)胞以2.5％戊二醛固定12 h，經(jīng)O．1 m01／I．PBS沖洗后，以4％鋨酸固定，乙醇梯度脫水，經(jīng)臨界點(diǎn)干燥、噴金后，用掃描電鏡(SEM)觀察。2結(jié)果與分析

2．1煙蚜繭蜂在寄主體內(nèi)的發(fā)育

煙蚜繭蜂雌蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)育成熟的卵為卵形或梨形，通?？梢?jiàn)分隔(圖3)，卵長(zhǎng)(75.0±5.0)μm，卵寬(25.0±5.1)μm；蜂卵在通過(guò)雌蜂產(chǎn)卵器時(shí)受到機(jī)械擠壓，蜂卵的中部稍稍凸起，一般呈檸檬形或長(zhǎng)梭形，初產(chǎn)卵長(zhǎng)(80.3±5.0)μm，寬(27.4±2.3)μm，卵期一般數(shù)小時(shí)至幾天；卵在發(fā)育過(guò)程中體積迅速增大，到幼蟲(chóng)即將孵化時(shí)卵長(zhǎng)(437.0±26.9)μm，寬(242.3±8.0)μm；當(dāng)卵孵化后，進(jìn)入幼蟲(chóng)發(fā)育期和蛹期，從1齡幼蟲(chóng)的體長(zhǎng)(520.0±62.7)μm，體寬(252.9±9.7)μm迅速增長(zhǎng)到4齡幼蟲(chóng)的體長(zhǎng)(2 300.2±129.1)μm，體寬(700.3±20.4)μm，此時(shí)的發(fā)育主要應(yīng)用卵黃內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

2．2畸形細(xì)胞的產(chǎn)生

煙蚜繭蜂蜂卵從初產(chǎn)到幼蜂孵化，通過(guò)胚胎外透明的漿膜能清晰看到，用蕃紅染色呈淡綠色(而蚜蟲(chóng)組織經(jīng)染色后呈現(xiàn)紅色)，通常在卵的前極漿膜先分化成畸形細(xì)胞，隨后其后極漿膜也形成畸形細(xì)胞。當(dāng)幼蜂即將孵化時(shí)，隨著胚胎的扭動(dòng)，可見(jiàn)卵的前后極已有球形的游離狀細(xì)胞在卯殼內(nèi)滾動(dòng)，產(chǎn)卵后33～3 6 h，幼蜂孵化時(shí)，卵殼和漿膜層常常從卵的中上部一側(cè)破裂，隨幼蜂的脫出，有部分畸形細(xì)胞以單個(gè)或細(xì)胞團(tuán)的形式釋放到寄辛血淋巴中，仍有部分細(xì)胞暫時(shí)停留在卵殼中，隨后才分散

到寄主血腔中。而中間的單層漿膜則繼續(xù)貼附在初孵的1齡幼蜂體上，孵化后數(shù)小時(shí)以細(xì)胞狀從幼蜂體脫落(圖4)。本研究與Dahlman等報(bào)道的結(jié)果相吻合。

2．3畸形細(xì)胞的發(fā)育

通常情況下，畸形細(xì)胞呈球形或橢圓形，釋放到寄主血淋巴中的顏色為白色或淡綠色，這與寄主血細(xì)胞的淡黃色相區(qū)別，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其體積迅速增加，由初始的直徑(22.1±6.5)μm至寄生后第5天達(dá)最大為(30.1±8.5)μm(圖1)。但是，其大小受著多種因素的影響，隨著寄主的齡期和外界因素等不同而有差異，即使是相同條件相同齡期其大小也有不同，最小的畸形細(xì)胞直徑僅為9 μm，最大可達(dá)100 μm；畸形細(xì)胞雖然染色體可增加許多倍，但是細(xì)胞不進(jìn)行有絲分裂。當(dāng)幼蜂完成在寄主體內(nèi)的發(fā)育時(shí)，畸形細(xì)胞的體積變小。

由圖2可以看出，蜂卵孵化時(shí)，漿膜釋放游離到寄主血淋巴中的畸形細(xì)胞的數(shù)目每胚胎平均為(150±32)個(gè)，隨著幼蜂的發(fā)育數(shù)量呈下降趨勢(shì)。其原因可能是畸形細(xì)胞的退化或寄主卵的胞吐作用或幼蜂的攝取。但Vinson and Lewis報(bào)道的寄生蜂體內(nèi)的畸形細(xì)胞的數(shù)目保持不變。從這一點(diǎn)來(lái)講，畸形細(xì)胞的數(shù)日變化還有待進(jìn)一步的研究。

2．4畸形細(xì)胞的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)

在電光源顯微鏡(OBH型)下就能見(jiàn)到剛剛釋放的畸形細(xì)胞，大小與寄主血細(xì)胞相近，一般球形或橢圓形，呈亮白色(圖4)。通過(guò)掃描電鏡SEM觀察，1日齡畸形細(xì)胞的細(xì)胞核圓形或卵圓形，占據(jù)整個(gè)細(xì)胞的大部分體積，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量較少，細(xì)胞表面微絨毛短小且稀疏，脂滴和蛋白質(zhì)含量較少。當(dāng)畸形細(xì)胞發(fā)育成熟達(dá)4日齡時(shí)，細(xì)胞核變大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量增多，微絨毛較1日齡濃密并且更長(zhǎng)，脂滴和蛋白質(zhì)含量也隨之增多，這表明畸形細(xì)胞代謝活動(dòng)旺盛，吸收寄主營(yíng)養(yǎng)和分泌蛋白質(zhì)的能力較1日齡增強(qiáng)(圖5)。由于試驗(yàn)條件限制，本研究沒(méi)有觀察到Buron和Beckage報(bào)道的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空腔，細(xì)胞衰老的情況。

3討論

現(xiàn)有資料表明，畸形細(xì)胞均來(lái)源于漿膜。寄生蜂蜂卵孵化時(shí)，漿膜分離成單個(gè)的或小的細(xì)胞團(tuán)，隨蜂卵孵化釋放到寄主血淋巴中成為獨(dú)立分散的畸形細(xì)胞。本文研究表明畸形細(xì)胞由單層漿膜發(fā)育而成，這與秦啟聯(lián)研究的中紅側(cè)溝繭蜂(Microplitismediator)的畸形細(xì)胞的來(lái)源相一致。

因漿膜層中間部分退化后形成了畸形細(xì)胞，因此造成每胚胎釋放細(xì)胞的數(shù)量隨個(gè)體發(fā)育的不同而有差異，卵在體外培養(yǎng)所釋放的畸形細(xì)胞明顯少于煙蚜繭蜂在自然狀態(tài)下寄生所釋放的數(shù)量，并認(rèn)為在自然狀態(tài)下寄生的煙蚜繭蜂所釋放的畸形細(xì)胞數(shù)量要多于溫室內(nèi)培養(yǎng)的煙蚜繭蜂的。并且，自然寄生和體外培養(yǎng)釋放的畸形細(xì)胞的直徑要明顯大于溫室內(nèi)的。從而表明，寄主的營(yíng)養(yǎng)及生理?xiàng)l件影響畸形細(xì)胞的產(chǎn)生及隨后發(fā)育。

畸形細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，各種類(lèi)型溶酶體和分泌酶的出現(xiàn)也說(shuō)明了細(xì)胞內(nèi)部正經(jīng)歷著蛋白質(zhì)的分解代謝。當(dāng)幼蜂即將完成在寄主體內(nèi)的發(fā)育時(shí)，畸形細(xì)胞的體積變小，這表明細(xì)胞正經(jīng)歷內(nèi)部的解體或向寄主中釋放了貯存的蛋白質(zhì)。

畸形細(xì)胞的數(shù)量在寄主體內(nèi)發(fā)育呈下降趨勢(shì)或完全消失。本研究認(rèn)為畸形細(xì)胞數(shù)量下降或與幼蜂直接取食作用或與畸形細(xì)胞自身的變形、解體有關(guān)。但是至于畸形細(xì)胞，只是寄生蜂一般性的食物，還是具有其他特殊的生理方面的意義，這個(gè)問(wèn)題還有待深入的研究。隨著幼蜂發(fā)育成熟，寄主血淋巴中生理?xiàng)l件的惡化，畸形細(xì)胞的活性下降。在解剖鏡下畸形細(xì)胞由明亮透明而轉(zhuǎn)變?yōu)槲郯咨?，因而認(rèn)為畸形細(xì)胞自身的瓦解是造成其數(shù)量下降的主要原因。本研究還表明，當(dāng)畸形細(xì)胞發(fā)育體積達(dá)到最大時(shí)，正是幼蜂進(jìn)入2齡，取食寄主血淋巴，進(jìn)人生長(zhǎng)和發(fā)育的快速增長(zhǎng)期，這暗示了畸形細(xì)胞和幼蜂發(fā)育的同步性。