轉(zhuǎn)基因植物重組ＤＮＡ和表達(dá)蛋白的環(huán)境分子行為

陳　洋　張永軍　吳孔明　彭于發(fā)　郭予元

摘要：轉(zhuǎn)基因植物的安全性已經(jīng)在全球范圍內(nèi)引起了普遍關(guān)注。本文從分子水平上就轉(zhuǎn)基因植物的重組DNA在環(huán)境中的降解動(dòng)態(tài)、轉(zhuǎn)基因植物重組DNA在生物體內(nèi)的傳遞、轉(zhuǎn)基因植物殺蟲蛋白在環(huán)境中的降解及在食物鏈間的傳遞等有關(guān)研究進(jìn)展作一簡要介紹。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因植物；重組DNA和蛋白；降解和傳遞；食物鏈

中圖分類號：Q 78

1引言

轉(zhuǎn)基因作物自1996年在美國商業(yè)化種植，已經(jīng)歷了10年的發(fā)展，到2006年，全球轉(zhuǎn)基因作物播種面積超過1億hm²，美國、阿根廷、巴西、加拿大、中國：等國轉(zhuǎn)基因作物的總種植面積超過8 900萬hm²。目前已獲得的轉(zhuǎn)基因植物主要有棉花、大豆、玉米、煙草、番茄、馬鈴薯等。與此同時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物的安全性已經(jīng)在全球范圍內(nèi)引起了普遍關(guān)注，尤其是轉(zhuǎn)基因植物重組DNA和表達(dá)蛋白的環(huán)境分子行為成為國際研究熱點(diǎn)之一。轉(zhuǎn)基因植物的重組DNA可以作為自由的DNA在環(huán)境中活動(dòng)通過植物的根部和花粉進(jìn)行擴(kuò)散，在土壤中殘留而對一些微生物造成影響，還可以經(jīng)過水平和垂直傳播，滲透到農(nóng)田周圍的地下水和其他水體中，而對一些細(xì)菌等微生物具有潛在影響。重組蛋白在轉(zhuǎn)基因植株的整個(gè)生育期都有表達(dá)，使取食而存活下來的靶標(biāo)及非靶標(biāo)昆蟲體內(nèi)的組織器官會(huì)不同程度的含有轉(zhuǎn)基因蛋白，當(dāng)天敵取食這些靶標(biāo)和非靶標(biāo)昆蟲時(shí)，這些重組蛋白就有可能傳遞到其天敵的體內(nèi)，直接或間接通過食物鏈(網(wǎng))對天敵的數(shù)量和質(zhì)量產(chǎn)生影響。重組蛋白還可以通過根系的分泌或者植株殘?bào)w的降解進(jìn)入土壤中，有可能對土壤生物系統(tǒng)產(chǎn)生影響。

2轉(zhuǎn)基因植物重組DNA的降解動(dòng)態(tài)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)可對特定核苷酸片斷進(jìn)行指數(shù)級的擴(kuò)增，在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后，通過凝膠電泳的方法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析。Widmer等人最先用PCR手段對田間土壤中殘留的植物基因組DNA進(jìn)行了定量分析。隨后，Alvarez等采用PcR技術(shù)對與黏土礦物結(jié)合的DNA進(jìn)行了擴(kuò)增。Lutz等利用PCR技術(shù)把非重組基因rubisco(核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶基因)與重組crylAb基因在轉(zhuǎn)基因玉米青貯時(shí)期的降解進(jìn)行了比較。根據(jù)兩種基因的全長，對rubisco基因設(shè)計(jì)了5對引物，相對應(yīng)的片斷大小分別為：173、896、1 197、1 753和2 521 bp；對crylAb基因設(shè)計(jì)了4對引物，相對應(yīng)的片斷大小分別為：211、420、727 bp和1 423 bp。rubisco基因的173 bp片斷在玉米殘?bào)w內(nèi)61 d后仍然可以檢測到，到第30天為止，還可以檢測到1 197 bp的片斷，但是2 521 bp的片段只有在第1天出現(xiàn)。另外，直到第61天還可以檢測到211和420 bp的crylAb基因片段，727 bp片斷在第30天內(nèi)可以檢測到，而1 423 bp的片段在前6天可內(nèi)檢測到。因此認(rèn)為crylAb基因的降解過程與非重組基因rubisco的降解過程是相似的。

無論定性還是定量分析，分析的都是PCR的終產(chǎn)物。但是在許多情況下，所感興趣的是未經(jīng)PCR信號放大之前的起始模板量。實(shí)時(shí)定量PCR就是通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時(shí)檢測從而實(shí)現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在DNA量比較少的情況下，可以應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法對重組DNA進(jìn)行檢測。一些轉(zhuǎn)基因植物具有抗生素基因作為選擇標(biāo)記，這些抗生素基因盡管經(jīng)過生命體和非生命體的降解，例如：微生物的、物理的、化學(xué)的降解，但是這些細(xì)胞外DNA仍可以作為自由的DNA在環(huán)境中活動(dòng)，并且可能被一些水中的細(xì)菌所利用，使得它們獲得抗性，因此可能對環(huán)境和人類健康存在潛在的危害。Zhu用一種高靈敏度的sYBR Green Ⅰ作為熒光染料的實(shí)時(shí)定量PCR方法對轉(zhuǎn)Bt基因玉米(MON863)中的nptⅡ(新霉素磷酸基轉(zhuǎn)移酶Ⅱ基因)進(jìn)行了定量分析，并且監(jiān)測了兩種地下水和河流水中npt Ⅱ基因降解的動(dòng)態(tài)。實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)表明，兩種地下水和河流水中的DNA擴(kuò)增模式相似；3種水質(zhì)高壓滅菌處理后的Ct值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))沒有改變，表明了高壓滅菌處理中的DNA的穩(wěn)定性。在3種水質(zhì)的未被處理和過濾除菌處理中，在48～96 h內(nèi)DNA的含量從0。8 mg／mL降到0.008 mg／mL，與此相反，高壓滅菌的水中DNA的含量沒有改變。因此認(rèn)為不同的水質(zhì)和環(huán)境條件可能是影響DNA降解速度的因素，而較低的溫度是影響微生物和酶的活性進(jìn)而導(dǎo)致DNA降解減慢的原因之一。Douville等人也利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因玉米地周圍的不同環(huán)境中crylAb基因的存在和殘留進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)crylAb基因在表面水和沉淀物中分別可以保持21 d和40 d，即使是過濾除菌的表面水中的crylAb基因的半衰期也沒有明顯增長。在黏沙土沉淀物中40 d以后可以檢測到來源于Bt玉米的crylAb基因，在距離玉米地下游的82 km處的水中仍然可以檢測到crylAb基因。Gebhard等選取了3對特異性引物來擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因重組DNA，在田間情況下，幾個(gè)月后也可以檢測到轉(zhuǎn)基因甜菜DNA組中的769bp npt Ⅱ基因。

3轉(zhuǎn)基因植物的重組DNA在生物體內(nèi)的傳遞和降解

有些學(xué)者認(rèn)為轉(zhuǎn)基因煙草完整的重組DNA經(jīng)過自然轉(zhuǎn)化有可能進(jìn)入細(xì)菌的基因組中。Rossi等人研究了來源于轉(zhuǎn)基因玉米飼料中的crylAb基因在小雞消化道中的降解。Zein基因是具有高拷貝數(shù)的玉米基因，作為玉米的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。crylAb基因是插入到玉米系MON 810中的修飾后的單拷貝Bt抗蟲基因。作者選取了1 800 bp的片段長度作為一個(gè)最小化的功能單位，能夠編碼整個(gè)Bt毒素蛋白。通過監(jiān)測crylAb轉(zhuǎn)基因可以來檢測轉(zhuǎn)基因玉米的重組DNA。另外，Sh-2基因是雞卵黃原蛋白基因，也是玉米的一種單拷貝基因，與crylAb大小相似，可以作為對照。作者比較了轉(zhuǎn)基因植物的DNA降解是否表現(xiàn)出與非轉(zhuǎn)基因植物的DNA降解不同。研究發(fā)現(xiàn)，可以在雞所有的胃腸部分監(jiān)測到Zein基因片斷，并且在取食轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米飼料的雞中檢測到的Zein基因沒有差異。在空腸、盲腸和血液中都不能擴(kuò)增到1 800 bp的crylAb基因和Sh-2基因，并且超過500 bp的DNA片斷未在腸的末端區(qū)域檢出。轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物處理中的DNA檢出頻率沒有顯著區(qū)別，這表明基因修飾沒有對DNA降解過程產(chǎn)生顯著影響。因此，Rossi認(rèn)為來源于轉(zhuǎn)基因植物飼料中的DNA與來源于常規(guī)植物飼料中的DNA最終在環(huán)境中的歸宿是一樣的。

4轉(zhuǎn)基因植物殺蟲蛋白在環(huán)境中的降解

轉(zhuǎn)基因植物的根系分泌物中有可能含有重組蛋白，同時(shí)收獲后的轉(zhuǎn)基因植物的殘?bào)w進(jìn)入到土壤生態(tài)系統(tǒng)，可能對土壤微生物系統(tǒng)造成影響。已有研究表明，在轉(zhuǎn)基因玉米、水稻和馬鈴薯的根系分泌物中檢測到cry基因編碼的殺蟲蛋白，但是轉(zhuǎn)基因棉花和煙草的根系分泌物中未檢測到殺蟲蛋白。Hopkins等研究表明，在實(shí)驗(yàn)室條件下，向土壤中加入的轉(zhuǎn)Bt基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米殘?jiān)姆纸鉀]有明顯的差別，并且已分解的植物組織和土壤混合物中的Bt殺蟲蛋白在實(shí)驗(yàn)室孵育的過程中迅速降解，在14 d以后低于檢測極限。Baumgarte等在田間對轉(zhuǎn)基因玉米(MON810)根系物及土壤進(jìn)行抽樣，采用ELISA方法測定了其中crylAb蛋白的含量。在土壤中的CrylAb蛋白含量要比根系物中的含量(1 g土壤中的含量為0.1～10 ng)要低，并且在收獲后的土壤中翌年4月份后仍然可以檢出CrylAb蛋白，含量是0.21 ng／g，而此時(shí)葉片殘?bào)w中的蛋白含量高達(dá)21 ng／g，根殘?bào)w的含量更高一些達(dá)到183 ng／g，根殘?bào)w中的蛋白含量僅為完整根部的12％。隨后過2個(gè)月以后抽樣發(fā)現(xiàn)，蛋白進(jìn)一步迅速降解。

Zwahlen等同樣用ELISA方法研究了瑞士種植區(qū)的兩塊田地的轉(zhuǎn)Bt基因玉米葉片的crylab毒蛋白在秋季、冬季和次年春季的降解情況。第1個(gè)處理中植物材料切割成大片裝進(jìn)有大網(wǎng)眼的垃圾袋中然后埋在土壤中，模仿耕作系統(tǒng)中的土壤內(nèi)玉米殘?jiān)?。在?個(gè)月里沒有發(fā)現(xiàn)crylAb毒蛋白降解。在第2個(gè)月中，crylAb毒蛋白的濃度卜降到原始濃度的20％，在冬季沒有進(jìn)一步的降解。次年春天氣溫上升后，毒蛋白繼續(xù)緩慢降解，直到次年6月仍然可以檢測到毒蛋白。第2個(gè)處理模擬在免耕系統(tǒng)中的降解，把植物材料直接放在土壤的表面，crylAb毒蛋白濃度在40 d內(nèi)降低到初始濃度的38％。毒蛋白在試驗(yàn)結(jié)束的200 d后持續(xù)降解。直到翌年6月份，CrylAb毒蛋白的量只有最初的0.3％。Lutz等人采用ELISA方法研究了青貯玉米飼料中的crylAb蛋白降解動(dòng)態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)，在43 h之內(nèi)crylAb蛋白沒有顯著的降解，在此后的20 d和60 dCrylAb蛋白有顯著的降低。同時(shí)用免疫印跡方法研究發(fā)現(xiàn)，在儲(chǔ)存期的前兩天內(nèi)60 kD大小的有活性的CrylAb蛋白存在，且信號很強(qiáng)，在第8天仍然可以檢測到微弱陽性信號，但是在12 d以后沒有發(fā)現(xiàn)有活性的CrylAb蛋白。

Abmad對土壤和蚯蚓的腸道和排泄物中的cry3Abl蛋白進(jìn)行了檢測，在罐子中的土壤和接觸Bt玉米根部的蚯蚓的腸道和排泄物都檢測到了Cry3Abl蛋白，在12 d和33 d上述蛋白含量沒有顯著差異。而另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在美國Manhat～tan(曼哈頓島)附近，連續(xù)種植轉(zhuǎn)基因玉米最初的1年和以后的3年里，利用ELISA方法檢測不到任何一個(gè)從Bt玉米混合田及非Bt玉米田土壤樣本中的cry3Abl蛋白。但是，在美國的scandia(斯堪的亞)附近種植轉(zhuǎn)基因玉米的第1年的土壤中檢測到少量的Cry3Abl蛋白，含量為干重3.38～6.89 ng／g。這些發(fā)現(xiàn)表明從根部分泌的或者腐爛的植株殘?bào)w的cry3Ab1很快就會(huì)在土壤中降解，殘留時(shí)間很短。

5轉(zhuǎn)基因植物殺蟲蛋白食物鏈間的傳遞

重組蛋白在植物的整個(gè)生育期得到持續(xù)表達(dá)，在對靶標(biāo)昆蟲起到良好控制作用的同時(shí)，也對一些非靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生了影響。對取食轉(zhuǎn)基因玉米的禾薊馬(Frankliniella tenuicornis Uzel)不同時(shí)期體內(nèi)的crylAb毒素進(jìn)行定量分析，并對毒素在成蟲體內(nèi)的殘留時(shí)間進(jìn)行研究，數(shù)據(jù)表明在禾薊馬的幼蟲和成蟲體內(nèi)Bt毒素的含量最高，在不進(jìn)食的預(yù)蛹期和蛹期沒有檢測到Bt毒素的存在。在成蟲體內(nèi)Bt毒素的殘留時(shí)間很短，在24 h之內(nèi)，CrylAb毒素含量減少了97％量，8 d之后檢測不到Bt毒素的存在。Howald等人研究了轉(zhuǎn)基因油菜對非靶標(biāo)食草蟲黃翅菜葉蜂[Athalia rosae(Linnaeus)]的影響。測定了Bt油菜葉片、取食Bt油菜的黃翅菜葉蜂的排泄物、各齡期幼蟲、蛹和成蟲中CrylAc蛋白的含量。在幼蟲體內(nèi)和糞便內(nèi)檢測到的CrylAc蛋白的含量要比在葉片中的含量少。在幼蟲、蛹和成蟲體內(nèi)都檢測不到crylAc蛋白。因此認(rèn)為crylAc蛋白不會(huì)對黃翅菜葉蜂本身產(chǎn)生影響，由于在它消化和排泄后依然可以檢測到蛋白的存在，因此有可能對其他生物體間接造成影響。weber等人的研究也表明，盡管馬陸排泄掉了大多數(shù)的Bt蛋白，Bt蛋白不會(huì)對它造成影響，但是它的排泄物中的Bt蛋白仍然有活性，這就有可能對其他的土壤生物造成影響。

靶標(biāo)或非靶標(biāo)害蟲的體內(nèi)都會(huì)不同程度地含有重組蛋白，直接或間接地對捕食性天敵和寄生性天敵產(chǎn)生影響[。已有很多報(bào)道轉(zhuǎn)基因作物對捕食者幼蟲的發(fā)育歷期及死亡率，蛹重及成蟲存活時(shí)期的影響。Duttin等人也對轉(zhuǎn)基因玉米上的3種草食性昆蟲體內(nèi)的毒蛋白進(jìn)行了測定。在二斑葉螨(Tetranychus urticae Koch)中檢測到CrylAb毒素的含量最高，為2.5 μg／g，其次是棉貪夜蛾[Spodo ptera littoralis(Boisduval)]，為0.72 μg／g，在禾谷縊管蚜[Rhopalosi phum padi(Linnaeus)]中只能檢測到很痕量的毒素。當(dāng)給普通草蛉[Chryso perla carnea(Stephen)]飼以上述3種草食性昆蟲后，取食二斑葉螨和禾谷縊管蚜的普通草蛉的死亡率、發(fā)育歷期和體重沒有受到影響。相反，當(dāng)給普通草蛉喂了棉貪夜蛾后，表現(xiàn)出了明顯的死亡率上升和發(fā)育延遲。二斑葉螨和棉貪夜蛾雖然體內(nèi)都含有Bt毒素，但是對普通草蛉的影響卻不相同，可能是因?yàn)槠胀ú蒡葘γ挢澮苟甑牟妒沉可俸虰t毒素的交互作用共同導(dǎo)致了普通草蛉取食了棉貪夜蛾后所產(chǎn)生的消極效應(yīng)。

Torres等人對轉(zhuǎn)基因棉花一害蟲一捕食者3級食物鏈進(jìn)行了研究，選取了4種草食性昆蟲、7種捕食性天敵，在甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)檢測到的crylAc蛋白只有14％傳遞到了捕食性斑腹刺益蝽[Podisusmaculiventris(say)]體內(nèi)，這就表明crylAc蛋白可以在3級營養(yǎng)階層間傳遞。

為了驗(yàn)證捕食者是否直接受Bt毒素的影響，Jorge等人檢測了田間代表3個(gè)營養(yǎng)級的材料，即：轉(zhuǎn)基因棉花DPL 458RR(轉(zhuǎn)crylAc基因棉花)，取食轉(zhuǎn)基因棉花的甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hnbner)]，及其雜食捕食性天敵大眼長蝽[Geoco-ris punctipes(Say)]中crylAb蛋白的含量。取食轉(zhuǎn)基因棉花葉片的甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)含有Bt毒素，這樣Bt毒素通過甜菜夜蛾幼蟲，使大眼長蝽幼蟲和成蟲分別有機(jī)會(huì)接觸到葉片中原始含量的81％和76％的毒蛋白，但是在大眼長蝽成蟲體內(nèi)沒有檢測到CrylAc蛋白。也有研究表明在一些捕食性天敵的體內(nèi)可以檢測到CrylAc毒蛋白的存在。

couty等人報(bào)道GNA可以通過營養(yǎng)階層傳遞，GNA對寄生蜂[Aphidius ervi(Haliday)]的影響是和GNA的濃度有關(guān)。寄生蜂的幼蟲可以排泄出大部分已經(jīng)消化的GNA，但是可以在蛹中檢測到一小部分的GNA。

室內(nèi)對轉(zhuǎn)基因水稻KMD1中的CrylAb毒蛋白經(jīng)食物鏈在幾種主要害蟲及其捕食性天敵體內(nèi)的積累進(jìn)行了研究，表明二化螟[Chilo suppressalis(walker)]和稻眼蝶(Mycalesis gotama Moore)幼蟲體內(nèi)的crylAb蛋白含量均隨取食時(shí)間延長逐漸下降，二化螟和稻眼蝶幼蟲的糞便中均檢測到較高濃度的CrylAb蛋白，二化螟幼蟲血淋巴中檢測到CrylAb蛋白。褐飛虱(Nila parvata lugens Stal)、麥長管蚜(Macrosiphum miscanthi)以及飼喂取食過KMDl的二化螟或稻眼蝶幼蟲的擬水狼蛛[Pi-rata subparaticus(Boes.et Str.)]體內(nèi)都含有一定濃度的CrylAb，這就表明crylAb蛋白可以沿著水稻－害蟲－天敵食物鏈傳遞。

轉(zhuǎn)基因植物的花粉或花蜜中也不同程度的含有重組蛋白，這就有可能對一些傳粉昆蟲或重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲造成影響。因?yàn)镋LISA方法存在檢測下限，所以認(rèn)為在飼喂轉(zhuǎn)基因玉米花粉的蜜蜂成蟲的下咽腺中未檢測到CrylAb蛋白，轉(zhuǎn)crylAb基因玉米花粉飼喂異色瓢蟲[Harmonia axyridis(Pal-las)]后，在瓢蟲體內(nèi)也未檢測到Bt殺蟲蛋白，轉(zhuǎn)crylA6玉米花粉對異色瓢蟲生長發(fā)育沒有顯著負(fù)面影響，初步證明Bt玉米MON810花粉對異色瓢蟲是安全的。也有研究報(bào)道取食轉(zhuǎn)crylAc基因棉花花粉的意大利蜜蜂(Apis mellifera Linnaeus)6日齡幼蟲體內(nèi)能夠檢測到Bt殺蟲蛋白。