濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎造模方法的實(shí)驗(yàn)研究

　　摘要：目的：復(fù)制濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，探討該模型的客觀指標(biāo)評(píng)價(jià)體系。方法：采用高脂高糖飲食造成濕熱體質(zhì)，用三硝基苯磺酸(7NBS)和乙醇混合液灌腸誘發(fā)濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎，觀察大鼠證候、結(jié)腸病理學(xué)改變及血清白介素－6(IL－6)。結(jié)果：模型大鼠出現(xiàn)粘液便、懶動(dòng)、食欲減退等濕熱證候，病理切片可見結(jié)腸粘膜出現(xiàn)明顯潰瘍、病理學(xué)評(píng)分有顯著性差異(P＜0.01)，血清IL－6明顯升高(P＜0.01)。結(jié)論：采用飲食加化學(xué)刺激法首次成功復(fù)制出濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎的大鼠模型，并擬定證候、病理及免疫三大指標(biāo)體系。可為臨床和實(shí)驗(yàn)研究提供參考。
　　關(guān)鍵詞：濕熱證；潰瘍性結(jié)腸炎；模型；白介素－6
　　中圖分類號(hào)：R285.5　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
　　文章編號(hào)：1007－2349(2007)11－0037－03
　　
　　潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是臨床引起腹瀉的常見病和難治病，其辨證分型以濕熱型最常見，但在該病的造模實(shí)驗(yàn)研究當(dāng)中，目前只復(fù)制出肝郁脾虛和脾虛兩種動(dòng)物模型，尚未復(fù)制出最常見的濕熱型動(dòng)物模型，更未能建立該模型的客觀指標(biāo)評(píng)價(jià)體系?；谏鲜鰡栴}，本研究運(yùn)用中醫(yī)的病因病機(jī)理論及潰瘍性結(jié)腸炎的西醫(yī)發(fā)病機(jī)制學(xué)說，采用飲食加化學(xué)刺激的方法，首次成功復(fù)制出濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎的大鼠模，并初步擬定了客觀指標(biāo)評(píng)價(jià)體系，為臨床和實(shí)驗(yàn)研究提供成熟的動(dòng)物模型。具體實(shí)驗(yàn)情況如下。
　　
　　1 材料與方法
　　
　　1．1 材料
　　1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只3月齡SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體重(200±20)購(gòu)自廣東實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證編號(hào)：2006A027。
　　1．1．2 試劑及物品 三硝基苯磺酸由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)：026K5006。大鼠血清IL－6(EIJSA法檢測(cè))試劑盒由美國(guó)California R&B公司生產(chǎn)。紅星二鍋頭(酒精度為56°)為北京紅星股份有限公司產(chǎn)品；蜂蜜由海南卓灃蜂業(yè)有限公司生產(chǎn)。
　　1．1．3 儀器 EPICS公司高速離心機(jī)(HERAEUS－1.0R)，電子天平為上海臺(tái)之衡電子衡器有限公司產(chǎn)品，酶標(biāo)儀由Bio－Tek公司生產(chǎn)。
　　1．2 造模方法 采用高脂高糖飲食加化學(xué)刺激法。隨機(jī)選取9只大鼠為空白對(duì)照組，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。其余27只為造模組(其中18只另分別作治療和對(duì)照組，此文暫不討論)，以普通飼料喂養(yǎng)為基礎(chǔ)，自由飲用濃度為200s／L的蜜糖水，每日上午灌服豬油lOg／ks，約30min后再灌服56度白酒(紅星二鍋頭)10ml／k8，共持續(xù)10天，以造成內(nèi)因濕熱模型；于造模第11天禁食24h，用3％戊巴比妥鈉30rag／k8腹腔注射麻醉，予三硝基苯磺酸(TNBs)lOOmg／k8(約等于TNBs原液0.20ml／100g)加50％乙醇0.25ml，用直徑約1.5mm的聚丙烯管插入肛門上段約8cm后一次性注入上述混合試劑。造出濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型。
　　1．3 觀察指標(biāo)
　　1．3．1 一般情況 泄瀉程度、大便的性狀、顏色、氣味、精神狀態(tài)、飲食量、毛發(fā)等，計(jì)算24h濕糞重量和記錄體重。
　　1．3．2 評(píng)分 肉眼觀察結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)改變并按表1進(jìn)行評(píng)分。
　　1．3．3 血清 IL－6檢測(cè)。
　　1．3．4 病理切片 觀察結(jié)腸病理改變。結(jié)果見表l。
　　
　　1．4 標(biāo)本處理和指標(biāo)檢測(cè)
　　1．4．1 血標(biāo)本 造模后觀察72h，確定模型穩(wěn)定，用ELISA法檢測(cè)空白及模型組大鼠血清IL－6含量，結(jié)果用ng／L表示。
　　1．4．2 結(jié)腸標(biāo)本 頸椎脫臼處死大鼠，剖腹取距離肛門約8cm結(jié)腸一段做HE染色。
　　1．4．3 糞便 用鼠籠收集大鼠24h濕糞，用電子天平稱取濕糞重量。
　　1．5 統(tǒng)計(jì)方法 采用t檢驗(yàn)。
　　
　　2 結(jié)果
　　
　　2．1 證候 濕熱造模期間部分大鼠出現(xiàn)短時(shí)間站立不穩(wěn)、呼吸加快的醉酒表現(xiàn)，飲食量和體重下降，且出現(xiàn)最具特征性的粘液便，常為兩節(jié)糞便由一絲狀粘液連結(jié)，不易拉斷(圖1)；糞便的顏色及穢味加深加重。灌腸造成潰瘍性結(jié)腸炎模型后，大鼠腹瀉明顯，24h濕糞重量見表2。其中部分大鼠出現(xiàn)明顯中毒性結(jié)腸擴(kuò)張和腸粘連(圖2及圖3)。
　　
　　
　　2．2 病理學(xué)檢查 模型組大鼠結(jié)腸粘膜出現(xiàn)明顯充血水腫，可見多個(gè)潰瘍?cè)睿罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，HE染色切片8/vv8Tg8fB+UcePqsW/02A==見圖4，評(píng)分見表2。
　　2．3 免疫學(xué)檢查 血清IL－6明顯升高，見表2。
　　
　　
　　3 討論
　　
　　3．1 造模結(jié)果評(píng)價(jià) IL－6是組織損傷后產(chǎn)生的一種重要細(xì)胞因子，具有免疫調(diào)節(jié)作用，它與炎癥的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。在濕熱證本質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)IL－6與濕熱的發(fā)生存在重要關(guān)系，故本研究選取IL－6作為濕熱的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。大鼠出現(xiàn)絲狀粘液便、懶動(dòng)、食欲及體重下降等表現(xiàn)，符合中醫(yī)理論“濕性粘滯、重濁、趨下”等特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)造模后IL－6顯著升高，且部分大鼠出現(xiàn)中毒性結(jié)腸擴(kuò)張、腸粘連等UC的嚴(yán)重并發(fā)癥，結(jié)合證候及病理學(xué)檢查，證實(shí)濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎的造模方法成功，且該模型穩(wěn)定性理想。
　　3．2 造模方法概述及評(píng)價(jià) 1984年Morris采用三硝基苯磺酸(TNtks)與乙醇混合液灌腸成功復(fù)制出UC的大鼠模型，此方法后來被廣泛參考和采用。當(dāng)前UC的造模方法主要分4類：化學(xué)性刺激法，主要是用三硝基苯磺酸、葡聚糖硫酸鈉、乙酸等灌腸造模，免疫學(xué)方法，主要有大鼠結(jié)腸細(xì)菌株模型、胎鼠結(jié)腸包埋法等；復(fù)合法，主要是將兩種化學(xué)方法進(jìn)行結(jié)合；中醫(yī)方面的造模方法目前只復(fù)制出肝郁脾虛及脾虛兩種證型的UC模型，尚未復(fù)制出最常見的濕熱型UC模型，且上述研究均沒有為特定證型的UC制定系統(tǒng)客觀的指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)體系。
　　3．3 濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎模型的客觀指標(biāo)評(píng)價(jià)體系 該模型是西醫(yī)疾病與特定中醫(yī)證型結(jié)合起來的模型。故應(yīng)“同時(shí)具備濕熱證和潰瘍性結(jié)腸炎的客觀指標(biāo)”。根據(jù)UC的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制。結(jié)合濕熱證本質(zhì)與免疫的關(guān)系，本研究擬定了以下濕熱型UC的客觀指標(biāo)評(píng)價(jià)體系：
　　3．3．1 濕熱證候指標(biāo) 糞便出現(xiàn)明顯粘液，黃色加深、味穢，排便次數(shù)增多且不易排盡而易粘附于肛周；食欲下降、懶動(dòng)、毛發(fā)失榮、對(duì)刺激反應(yīng)下降，體重減輕等。
　　3．3．2 病理學(xué)指標(biāo) 病理切片和評(píng)分。
　　3．3．3 免疫學(xué)指標(biāo) 如白介素、抗中性粒細(xì)胞抗體等。
　　3．4 本造模方法的細(xì)節(jié)及要點(diǎn)探討
　　3．4．1　防止灌腸液流出 灌腸后腸腔壓力增加且在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行操作，肛門處于松弛狀態(tài)，所以拔管后灌腸液容易流出肛門，故應(yīng)該采取以下措施避免：拔管前后使大鼠處于頭朝下、肛門朝上的體位；緩慢拔管后，按壓肛門至少2min。
　　3．4．2 麻醉藥及其劑量選擇 因?yàn)樵搶?shí)驗(yàn)要求動(dòng)物術(shù)中無掙扎且在術(shù)后蘇醒，故應(yīng)選取起效快且作用時(shí)間不宜過長(zhǎng)的麻醉藥。烏拉坦雖然起效快，但術(shù)后蘇醒需要的時(shí)間過長(zhǎng)，且麻醉過程中死亡率較高；乙醚起效快，但術(shù)中動(dòng)物易蘇醒不能配合手術(shù)。故3％戊巴比妥鈉是最理想的麻藥。術(shù)中發(fā)現(xiàn)若按0.1ml／100g的劑量，部分大鼠麻醉效果欠佳，追加到0.12ml／100g則麻醉效果理想，且動(dòng)物可在術(shù)后3h內(nèi)全部蘇