纈沙坦對(duì)兔動(dòng)脈成形術(shù)后血管內(nèi)膜增生及內(nèi)皮細(xì)胞ＣＤ３４表達(dá)的影響

盧輝和　劉亞軍　張　莉　盛臻強(qiáng)　王　毅　管耘園

【摘要】目的觀察血管緊張素ⅡⅠ型受體(ATl)拈抗劑纈沙坦對(duì)兔動(dòng)脈成形術(shù)后血管內(nèi)膜增生及內(nèi)皮細(xì)胞CD34表達(dá)的影響，探討ATl受體拮抗劑治療血管再狹窄的機(jī)制和作用。方法雄性新西蘭白兔24只，隨機(jī)分成3組：對(duì)照組始終以普通飼料飼養(yǎng)12周，不加任何處理；模型組和纈沙坦給予高膽固醇喂養(yǎng)，4周后行腹主動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫，繼續(xù)高膽固醇飲食4周后行球囊成形術(shù)，模型組繼續(xù)普通飼料飼養(yǎng)，而纈沙坦組給普通飼料＋纈沙坦10 nlg·kg^-1·d^-1喂養(yǎng)4周。12周末取腹主動(dòng)脈行病理形態(tài)學(xué)觀察及CD34免疫組織化學(xué)分析。結(jié)果與模型組比較，纈沙坦組內(nèi)膜厚度減少56.58％，內(nèi)膜面積減少66.81％。免疫組織化學(xué)分析顯示，纈沙坦組與模型組相比CD34表達(dá)增加(P＜0.01)。結(jié)論纈沙坦可以減輕兔腹主動(dòng)脈成形術(shù)后內(nèi)膜增生，其機(jī)制可能與促進(jìn)內(nèi)膜損傷后的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，提高內(nèi)皮修復(fù)功能有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】纈沙坦；血管成形術(shù)；再狹窄；CD34；內(nèi)皮細(xì)胞

冠心病介入治療已成為冠心病治療的主要手段之一，但術(shù)后的再狹窄嚴(yán)重影響了遠(yuǎn)期療效。再狹窄形成與血管內(nèi)皮的修復(fù)程度密切相關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞損傷的面積決定新生內(nèi)膜的增厚程度，損傷后內(nèi)皮層再生速度的快慢對(duì)新生內(nèi)膜增厚程度起著關(guān)鍵作用。內(nèi)皮在再狹窄中的作用愈來(lái)愈成為研究的熱點(diǎn)。本研究觀察纈沙坦對(duì)兔腹主動(dòng)脈球囊成形術(shù)后血管內(nèi)膜增殖和內(nèi)皮細(xì)胞CD34表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討ATl受體拮抗劑治療血管再狹窄的機(jī)制。

1材料與方法

1．1動(dòng)脈粥樣硬化模型

新西蘭大白兔24只(南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重(2.0±0.5)kg，隨機(jī)分成三組，每組8只。對(duì)照組始終以普通飼料喂養(yǎng)12周，不加任何處理；模型組和纈沙坦組，予高膽固醇飼料80 g／d，喂養(yǎng)4周后行腹主動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫。3％戊巴比妥(美國(guó)sigma公司)30 mg／kg靜脈麻醉，分離切開右側(cè)股動(dòng)脈，在DSA引導(dǎo)下，插入4F forgarty球囊導(dǎo)管(美國(guó)Baxtei Heahhthcare公司)至膈肌處，壓力泵注入優(yōu)維顯370充盈球囊(壓力400－600 kPa)，緩慢回拉導(dǎo)管到動(dòng)脈切口處，反復(fù)三次，剝脫血管內(nèi)皮。結(jié)扎血管，縫合切口，繼續(xù)予高膽固醇飲食。

1．2腹主動(dòng)脈球囊成形術(shù)

繼續(xù)高膽固醇飲食4周后行腹主動(dòng)脈球囊成形術(shù)，3％戊巴比妥30 mg／kg靜脈麻醉，分離切開左側(cè)股動(dòng)脈，在DSA引導(dǎo)下，插入4F forgarty球囊導(dǎo)管，對(duì)狹窄部位行血管成型術(shù)，反復(fù)3次，每次30 s，間隔1 min。結(jié)扎血管，縫合切口。模型組繼續(xù)喂普通飼料，而纈沙坦組普通飼料＋纈沙坦10 mg·kg^-1·d^-1(北京諾華制藥)喂養(yǎng)4周。

1．3組織形態(tài)學(xué)分析

切取所需腹主動(dòng)脈組織(不超過(guò)1 cm)置入10％福爾馬林固定液中，固定后行組織修整、洗滌，酒精逐級(jí)脫水，二甲苯置換組織塊中的酒精，石蠟包埋，蠟塊用切片機(jī)連續(xù)切成厚度4 μm的薄片，HE染色。用LEICA全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，選擇內(nèi)膜厚度和面積最大處計(jì)算血管腔內(nèi)膜的厚度、面積及中膜的厚度、面積。

1．4免疫組織化學(xué)分析

采用SP法測(cè)定內(nèi)膜CD34表達(dá)(試劑盒美國(guó)Zymed公司)。具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。每張切片在LEICA全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)上隨機(jī)計(jì)算5個(gè)400倍物鏡視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(P)及觀察細(xì)胞總數(shù)(A)，求出陽(yáng)性細(xì)胞百分率(P／A，％)。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0分析軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，多組間比較采用方差分析(one-way ANOVA)，組問(wèn)兩兩比較采用q檢驗(yàn)；率的比較采用χ²檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1組織形態(tài)學(xué)改變

肉眼可見對(duì)照組腹主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，無(wú)斑塊形成；模型組管壁有大量黃白色脂樣物向管腔凸出，并連成片狀；而纈沙坦組斑塊明顯減少。光鏡下，對(duì)照組兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜為內(nèi)皮細(xì)胞層，內(nèi)皮下有極少量結(jié)締組織，無(wú)平滑肌細(xì)胞存在；模型組內(nèi)膜明顯增厚，管腔明顯狹窄，內(nèi)膜內(nèi)大量泡沫細(xì)胞及不定形壞死物質(zhì)，內(nèi)膜下出現(xiàn)大量平滑肌細(xì)胞增生，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，為典型的分泌型細(xì)胞，細(xì)胞問(wèn)較多的膠原纖維；纈沙坦組內(nèi)膜也有不同程度的增厚，管腔有所狹窄，較多的中膜平滑肌細(xì)胞遷移至內(nèi)膜下增生，但內(nèi)膜增生及管腔狹窄程度均較模型組明顯減輕。三組動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜的厚度及形態(tài)學(xué)改變。

2．2免疫組織化學(xué)分析

CD34陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞漿呈棕黃色染色的細(xì)胞，對(duì)照組、模型組及纈沙坦組的CD34表達(dá)分別為(47.01±4.34)％、(68.75±3.00)％、(88.25±2.88)％。纈沙坦組與模型組比較，CD34陽(yáng)性表達(dá)明顯增多(P＜0.01)，且纈沙坦組新生內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊、完整，而模型組新生內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂、不完整。

3討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞具有許多重要的生理功能，如限制炎癥反應(yīng)、防止血管內(nèi)凝血系統(tǒng)激活和血栓形成等。結(jié)構(gòu)完整、功能正常的內(nèi)皮細(xì)胞一方面發(fā)揮著屏障作用，阻斷血管活性物質(zhì)對(duì)平滑肌細(xì)胞(SMC)的刺激作用，同時(shí)分泌肝素樣物質(zhì)，抑制SMC遷移增殖和分泌。內(nèi)皮細(xì)胞小面積的損傷可以迅速修復(fù)，SMC增殖反應(yīng)輕，可不產(chǎn)生內(nèi)膜增厚；內(nèi)皮細(xì)胞大面積損傷，內(nèi)皮細(xì)胞難以很快修復(fù)，SMC增殖反應(yīng)明顯而持久，可以產(chǎn)生較為嚴(yán)重的內(nèi)膜增厚和再狹窄。冠心病介入治療不可避免地?fù)p傷內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷使分泌抑制SMC增殖的肝素樣物質(zhì)減少，一氧化氮、前列腺環(huán)素分泌減少，內(nèi)皮素分泌增加，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)血管中層SMC的接觸抑制喪失，導(dǎo)致SMC大量增殖，新生內(nèi)膜增厚，出現(xiàn)再狹窄。大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮剝脫后的內(nèi)皮快速修復(fù)，盡管仍有SMC的增殖，但內(nèi)膜的增殖不明顯。內(nèi)皮微小損傷就可引起SMC的移行和增殖，但有內(nèi)皮覆蓋部分不會(huì)出現(xiàn)內(nèi)膜增生。Chandrasekar等和Kipshidze等研究顯示，促進(jìn)損傷部位內(nèi)皮細(xì)胞再生、恢復(fù)內(nèi)膜完整是有效防止再狹窄的關(guān)鍵。

研究表明，ATl受體拮抗劑能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，從而減輕血管再狹窄。ATl受體拮抗劑能夠改善心肌梗死后血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，但對(duì)球囊成形術(shù)后血管內(nèi)皮修復(fù)的影響國(guó)內(nèi)未見報(bào)道。CD34是相對(duì)分子質(zhì)量為(102～120)×10³、高度酸性的糖基化I型跨膜糖蛋白，屬表面分子唾液黏蛋白家族成員之一，主要表達(dá)細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。因此，本研究采用CD34標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞，觀察CD34的表達(dá)情況，探討球囊成形術(shù)后纈沙坦對(duì)血管內(nèi)膜增生及內(nèi)皮細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，纈沙坦組較模型組內(nèi)膜厚度減少56.58％，內(nèi)膜面積減少66.81％，進(jìn)一步證實(shí)纈沙坦能有效防治球囊擴(kuò)張成形術(shù)后血管的再狹窄。模型組及纈沙坦組的CD34表達(dá)分別為68.75％、88.25％，纈沙坦組比模型組CD34陽(yáng)性表達(dá)增多(P＜0.01)，且纈沙坦組新生內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊、完整，而模型組新生內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂、不完整。說(shuō)明血管成形術(shù)后，纈沙坦可以促進(jìn)血管內(nèi)皮的增生、修復(fù)，保持血管內(nèi)皮的完整性，從而發(fā)揮抑制血管的再狹窄作用。這為臨床防治血管成形術(shù)后再狹窄的治療提供了一個(gè)新的思路，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞愈合的藥物，可以有效地防治再狹窄。有趣的是在研究中觀察到纈沙坦組中膜厚度反而較模型組及對(duì)照組小，我們推測(cè)可能與纈沙坦促進(jìn)球囊成形術(shù)后血管SMC的凋亡有關(guān)。

ATl受體拮抗劑能夠促進(jìn)血管SMC的凋亡，但能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生。Bernard和Volpe等認(rèn)為，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)導(dǎo)致類上皮樣細(xì)胞而非梭形細(xì)胞的凋亡，且凋亡由ATl受體而非AT2受體所介導(dǎo)，AnglI介導(dǎo)血管SMC凋亡依賴其類型不同而有所差異，因而導(dǎo)致ATI受體拮抗劑對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管SMC產(chǎn)生相反的作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(VEGFR-2)特異地表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，是血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖的信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵受體。磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B(PI 3K／Akt)是抗細(xì)胞凋亡的重要途徑，Akt能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)促存活和抗凋亡基因的表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子引起的細(xì)胞增殖、凋亡和存活。Watanabe等和Grothusen等研究發(fā)現(xiàn)，ATl受體拮抗劑氯沙坦的代謝產(chǎn)物EXP3179通過(guò)活化VEGFR-2／PI 3K／Akt途徑，促進(jìn)一氧化氮合成酶(eNOS)的磷酸化，抑制導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞死亡的腫瘤壞死因子．a(chǎn)(TNF-a)，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮的增生、改善內(nèi)皮的功能。纈沙坦促進(jìn)血管內(nèi)皮的增生、保持內(nèi)皮增生后的完整性機(jī)制目前還不完全清楚，有待于進(jìn)一步研究。