血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑對大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷的保護(hù)作用

張　泓　孫耕耘

【摘要】目的研究血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體拮抗劑對大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷(ALI)的保護(hù)作用。方法取wistar大鼠60只，雌雄不拘，隨機(jī)分為三組：(1)正常對照組(10只)，給予大鼠靜注等量生理鹽水；(2)大腸肝菌脂多糖(LPS)組，分為3、6、12和24 h四個觀察組(每組均10只)，分別給大鼠注射LPS(10 mg／kg)，間隔不同的時間后將大鼠放血活殺，取肺組織待測；(3)LPS+AngⅡ受體拮抗劑組(10只)，先給予大鼠靜注AngⅡ受體拮抗劑[sar¹，Ile⁸]AngⅡ(20 μg／kg)處理，然后觀察6 h，放血活殺后取肺組織待測。分別以肺濕／干重比、伊文思藍(lán)法測定肺微血管通透性和肺組織病理變化，觀察LPS對大鼠肺組織的急性損傷作用以及Ang U受體拮抗劑對該損傷作用的影響。結(jié)果與對照組比較，LPS組各時相點大鼠肺組織W／D值顯著升高(P＜0.01)，致大鼠肺血管中伊文思藍(lán)染料向組織中滲漏顯著增多(P＜0.01)，LPS組出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤、水腫等損傷表現(xiàn)，總病理評分達(dá)(12.00±2.45)分；LPS+AngⅡ受體拮抗劑組大鼠肺組織濕／干重比、肺微血管蛋白滲出量和組織形態(tài)學(xué)變化均較LPS組顯著好轉(zhuǎn)。結(jié)論AngⅡ受體拮抗劑對大鼠內(nèi)毒素性ALl有保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】血管緊張素Ⅱ；受體拮抗劑；內(nèi)毒素；大鼠；肺損傷

急性肺損傷(ALI)是全身炎性反應(yīng)綜合征在肺部的表現(xiàn)，其本質(zhì)為肺微血管通透性升高所致的一種血管滲漏綜合征。研究證實，一方面內(nèi)毒素可造成肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascularendothelia1 cell，PMVEc)損傷，另一方面激活的PMVEC在肺局部炎癥反應(yīng)中起積極主動作用，它分泌一些炎癥因子及血管活性物質(zhì)，參與并放大肺局部炎癥效應(yīng)，導(dǎo)致肺內(nèi)皮通透性增加，致通氣／血流比值失衡和肺間質(zhì)及肺泡水腫，低氧血癥，最終導(dǎo)致ALI。

G-菌感染時全身及局部的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活，可致循環(huán)及組織局部的Ang II濃度升高，但升高的AngⅡ在ALI發(fā)生過程中對肺內(nèi)皮通透屏障究竟產(chǎn)生何種影響，其與G-菌內(nèi)毒素之間的相互作用如何，鮮見報道。

本研究擬在建立LPS誘導(dǎo)大鼠ALl模型的基礎(chǔ)上，觀察LPS誘導(dǎo)ALI損傷指標(biāo)的變化以及Ang II受體拮抗劑對LPS致傷作用的影響。

1材料與方法

1．1主要儀器與試劑

日立-850型熒光分光光度計：日本。BD-211電子天平：SATORIOUS，德國。電熱恒溫水浴鍋：上海市醫(yī)療器械五廠。電熱真空干燥箱：ZK-82A型，中國。大腸桿菌脂多糖(LPS)血清型(0111：B4)，[sar¹，Ile⁸]AngⅡ，均為美國Sigma公司產(chǎn)品。氯胺酮：上海第一生化藥業(yè)有限公司。伊文思藍(lán)染料(Evans blue dve，EBD)：美國Fluke公司產(chǎn)品。

1．2模型制作及試驗分組

參照路國華等和徐智等方法并加以改進(jìn)。取Wistar大鼠60只，(安徽醫(yī)科大學(xué)動物中心提供)雌雄不拘，隨機(jī)分為三組：(1)正常對照組(10只)；(2)LPS組，又分為3、6、12和24 h四個觀察組(每組均10只)；(3)LPS＋Ang II受體拮抗劑組(10只)。自制鼠籠固定大鼠，自尾靜脈注射LPS(10 mg／kg)；腹腔內(nèi)注射氯胺酮(20 mg／kg)麻醉；切斷雙側(cè)頸動脈放血活殺；以0.9％生理鹽水50 ml灌注右室直至流出的液體變清亮；迅速將肺臟取出。對照組注射等量生理鹽水。LPS＋AngⅡ受體拮抗劑組，先予大鼠靜注『Sar¹，Ile⁸]AngⅡ(20 μg／kg)處理，觀察6h后，將大鼠放血活殺取肺組織待測。

1．3觀察指標(biāo)與測定方法

(1)肺濕／干重比測定大鼠接受靜脈注射后，回鼠籠自由活動，注射完畢開始計時，致傷前和致傷后3、6、12和24 h點采樣。取左肺，盡量放出肺血管內(nèi)殘血，清洗肺組織；左肺組織稱量濕重；置真空干燥箱，80℃脫水72 h至重量不再變化；烤干后的肺組織稱量干重。以肺濕／干重比值(W，D)表示肺組織含水量。(2)伊文思藍(lán)法測定肺微血管通透性分別取0.1％EBD標(biāo)準(zhǔn)品0、5 μl、15 μl、20 μl、30 μl、40 μl，加入4 ml甲酰胺中，繪制EBD標(biāo)準(zhǔn)曲線，激發(fā)光波長620 nm，波寬10 nm；發(fā)射光波長683 nm，波寬8 nm。將數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：A=0.011X－0.001，r=0.99。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。距設(shè)定觀察時相點(6 h)前30 min，自大鼠尾靜脈注射EBD(30 mg／kg)；待染料循環(huán)30 min后，將大鼠放血活殺；以0.9％生理鹽水50 ml沖洗右室內(nèi)染料；取右肺下葉，于電子天平上稱取濕肺重量；將組織切碎浸入4 ml甲酰胺內(nèi)；置60℃水浴鍋內(nèi)48 h；取出離心，3900g離心10 min；上機(jī)，室溫下于620 nm／683 nm處測吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出EBD濃度，結(jié)果以mg dye／g hmg tissue表示。(3)肺組織病理觀察取右肺中葉以10％福爾馬林液(pH 7.2)固定，酒精干燥，石蠟包埋，切成6 μm厚度的切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。(4)病理形態(tài)學(xué)計分：根據(jù)肺間質(zhì)水腫、肺泡變性、炎細(xì)胞浸潤、肺泡出血、透明膜形成和肺不張改變，按程度無、輕、中、重分別計0、1、2、3分，累計總分予統(tǒng)計學(xué)處理。

1．4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1肺組織濕／干重比的變化

LPS組各時相點組肺含水量均顯著增高，表現(xiàn)為傷后3 h顯著升高，6 h達(dá)峰值，并持續(xù)至24 h。結(jié)果表明，靜脈注射LPS可致肺組織含水量升高，并在6～12 h內(nèi)升至最高，導(dǎo)致嚴(yán)重而持續(xù)的肺水腫(P＜0.01)。

2．2伊文思藍(lán)測定肺血管內(nèi)皮屏障蛋白滲出量

LPS組大鼠肺血管中EBD向組織中滲漏顯著增多，與正常對照組相比，單位組織中EBD濃度由(20.0±3.7)mg dye／g lung tissue升高至(45.6±2.5)mg dye／g lung tissue(P＜0.01)。

2．3肺組織的病理變化

對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡內(nèi)未見水腫液；LPS組3 h時肺泡間隔增厚，炎性細(xì)胞浸潤，6 h后，肺內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，以中性

粒細(xì)胞為主，伴出血、水腫和透明膜形成，24 h后肺間質(zhì)和肺泡水腫較前減輕，總病理評分達(dá)(12.00±2.45)分。

2．4ATl受體拮抗劑對大鼠內(nèi)毒素性ALI的影響

LPS＋AngⅡ受體拮抗劑組肺組織濕／干重比、肺微血管蛋白滲出量和組織形態(tài)學(xué)變化均較LPS組顯著好轉(zhuǎn)，病理評分(1.60±0.33)分，明顯低于LPS組(P＜0.01)。說明早期應(yīng)用[Sar¹，Ile⁸]AngⅡ可減輕ALI，對肺微血管通透性具有保護(hù)作用。

LPS組6 h時相點處肺W／D比顯著增高，[Sar¹，Ile⁸]AngⅡ可明顯減輕該變化(P＜0.01)，[Sar¹，Ile⁸]AngⅡ可顯著抑制LPS作用6h的致肺微血管蛋白滲出量增加效應(yīng)(P＜0.01)，LPS作用可致大鼠肺組織發(fā)生明顯損傷，而[Sar¹，Ile⁸]AngⅡ可減輕LPS作用所致ALI的病理改變。

3討論

ALI是多器官功能障礙綜合征在肺部的表現(xiàn)，其本質(zhì)是由內(nèi)毒素直接或間接損傷肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，肺毛細(xì)血管通透性增高的血管滲漏綜合征。內(nèi)毒素LPS是引起膿毒癥后繼發(fā)ALI的元兇，給動物注射LPS可復(fù)制ALI的主要特征，其機(jī)制是由于LPS直接或間接損傷PMVEC，使內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)、功能、表面特性等方面發(fā)生變化，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，肺微血管通透性增高。目前在內(nèi)毒素性ALI的基礎(chǔ)研究及臨床防治方面尚無實質(zhì)性突破，這就迫使相關(guān)研究尋找內(nèi)毒素對PMVEC損傷作用的新切入點，一旦找到能夠控制其作用的切入點，便可有效地防止ALI發(fā)生。本研究擬探討內(nèi)毒素性ALI時，內(nèi)毒素對肺微血管通透性的直接影響以及AngⅡ受體拮抗劑的保護(hù)作用及其機(jī)制。

為探討AngⅡ受體拮抗劑保護(hù)ALI肺微血管通透性的作用機(jī)制，筆者首先建立LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI模型。實驗結(jié)果顯示，LPS可損傷肺微血管內(nèi)皮，導(dǎo)致肺含水量及蛋白滲出量急劇增多；表現(xiàn)為肺濕／干重比和EBD值增高，以及特征性的ALI的病理改變。結(jié)果還顯示，AngⅡ拮抗劑對LPS致ALI有明顯保護(hù)作用。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(rennin angiotensin system，RAS)為循環(huán)激素內(nèi)分泌系統(tǒng)，AngⅡ是RAS的主要效應(yīng)分子。近來發(fā)現(xiàn)RAS不僅對血壓和血流起重要調(diào)節(jié)作用，還參與并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。有關(guān)膿毒癥的研究證實，AngⅡ參與并影響LPS致炎反應(yīng)的不同階段。AngⅡ與LPS之間的作用在膿毒癥極早期是相互拮抗的，AngⅡ可部分逆轉(zhuǎn)LPS對G蛋白耦聯(lián)受體的損傷效應(yīng)；隨著膿毒癥的進(jìn)一步發(fā)展，循環(huán)及局部RAS高度激活，AngⅡ水平升高，則對組織或器官功能紊亂的過程起維持和加重作用。AngⅡ本身作為炎性介質(zhì)還可直接誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。已知AngⅡ可通過多種機(jī)制影響肺損傷過程，如對肺泡上皮的促凋亡作用，介導(dǎo)肺動脈高壓和纖維化反應(yīng)等。筆者研究也證實，AngⅡ可致體外培養(yǎng)的PMVEC單層通透性增高。AngⅡ與內(nèi)毒素之間的作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本研究結(jié)果表明，AngⅡ拮抗劑對大鼠內(nèi)毒素性ALI有保護(hù)性干預(yù)作用，可顯著降低大鼠內(nèi)毒素性ALI的損傷程度，這一結(jié)論為臨床應(yīng)用AngⅡ受體拮抗劑治療ALI提供了理論依據(jù)。