血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑對(duì)大鼠機(jī)械通氣所致肺損傷的保護(hù)作用

馮　丹　姚尚龍　尚　游　武慶平　王立奎

【摘要】目的研究血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑洛沙坦對(duì)大鼠機(jī)械通氣所致肺損傷(VILI)的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法40只健康SD大鼠隨機(jī)均分成A、B、c、D四組：A組為對(duì)照組；B組為正常潮氣量機(jī)械通氣組，潮氣量(V_T)為10 ml／kg；c組為大潮氣量機(jī)械通氣通氣組，V_T為40ml／kg；D組為大潮氣量通氣加洛沙坦處理組，_T為4 0ml／kg，D組大鼠實(shí)驗(yàn)前30 min用血管緊張素Ⅱ受體(ATl型)特異性阻斷劑洛沙坦(Losartan)溶液30 m∥kg腹腔注射。B、c、D三組機(jī)械通氣頻率(P)均為80次／min，通氣時(shí)間均為2 h。實(shí)驗(yàn)完畢收集肺組織和肺泡灌洗液標(biāo)本。光鏡觀察肺病理改變，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)A、B、C三組肺組織中血管緊張素原的表達(dá)水平，TUNEL法檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)測(cè)定肺灌洗液總蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺濕／干比以及肺組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)的水平。結(jié)果B組和A組各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與A、B組相比，c組肺病理改變明顯，肺細(xì)胞凋亡顯著性增多，血管緊張素原的表達(dá)水平顯著增高(P＜0.01)，肺濕／干比、總蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、MPO等指標(biāo)均顯著性增高(P＜0.01)；與C組比較，D組肺病理改變明顯減輕，肺細(xì)胞凋亡、肺濕／干比、總蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、MPO等指標(biāo)均顯著性降低(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)論血管緊張素Ⅱ可能在VILI的致病機(jī)理中起著一定的作用，特異性阻斷血管緊張素Ⅱ受體(ATl型)能顯著減輕VILI時(shí)肺損傷和炎癥反應(yīng)的程度。

【關(guān)鍵詞】機(jī)械通氣所致肺損傷；機(jī)械通氣；洛沙坦

在人和大鼠的肺組織中存在著局部的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)，其中以血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)及其受體較為重要，在調(diào)節(jié)肺細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡等方面起著重要作用。ANGⅡ可能在各種急性肺損傷中起著重要的作用。研究證明，在多種原因所致的急性肺損傷中，肺組織中ANGⅡ的表達(dá)水平均顯著增高，而阻斷ANGⅡ受體或減少ANGⅡ的生成可以減輕多種原因所致的急性肺損傷，減輕肺水腫程度，抑制中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和肺細(xì)胞的凋亡。機(jī)械通氣所致的肺損傷(ventilator-induced lung injury，VILI)是肺功能?chē)?yán)重受損的患者行機(jī)械通氣支持治療時(shí)的常見(jiàn)并發(fā)癥，其主要致病機(jī)制之一可能是由于過(guò)度的機(jī)械刺激(如牽拉、切變力、剪切力等)激活了肺細(xì)胞多種致炎因子的表達(dá)，引起白細(xì)胞(特別是中性粒細(xì)胞)在肺組織中的“募集”，導(dǎo)致肺組織的急性炎性損傷。目前，ANGⅡ及其受體在VIU中的作用在國(guó)內(nèi)外還很少有人研究。本試驗(yàn)擬通過(guò)建立大鼠VILI實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以血管緊張素原(ANGⅡ的前體)的表達(dá)水平間接反映ANGⅡ的水平，以ANGⅡ受體(ATl型)特異性阻斷劑洛沙坦預(yù)處理VILI的大鼠，來(lái)研究ANGⅡ(ATl型)受體阻斷劑洛沙坦對(duì)大鼠機(jī)械通氣所致肺損傷(VILI)的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1材料與方法

1．1主要試劑

Tfizol提取液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒均購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司，PCR特異性引物購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，總蛋白和MPO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，F(xiàn)UNEL分析試劑盒為武漢博士德公司提供，AT₁受鞴異性的阻斷劑洛沙坦(Losartan)購(gòu)自美國(guó)Cayman公司。

1．2動(dòng)物與分組

40只健康SD大鼠，體質(zhì)量300～350 g，隨機(jī)應(yīng)分成A、B、C、D四組：A組空白對(duì)照組，不行機(jī)械通氣；B組為正常潮氣量通氣組，潮氣量(V_T)為10 ml／kg，呼吸頻率(P)為80次／min；C丑為大潮氣量機(jī)械通氣通氣組，V_T為40 ml／kg，P為80次／min；D組為大潮氣量機(jī)械通氣通氣加Losartan處理組，V_T為40 ml／kg，呼吸頻率(P)80次／min，D組大鼠在實(shí)驗(yàn)前30 min用Losartan溶液30 mg／kg腹腔注射(Losartan粉劑溶于PBS中)。

1．3動(dòng)物模型

20％烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠，起效后行氣管切開(kāi)，A組大鼠直接處死，其他各組大鼠則插入氣管導(dǎo)管(用膠管自制)行機(jī)械通氣(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠提供)，機(jī)械通氣參數(shù)統(tǒng)一設(shè)置成VT為40 ml／kg或10 ml／kg，呼吸頻率(RR)80次／min，吸／呼比(I：E)為1：2，PEEP為零，吸入氣體為室內(nèi)空氣。皮下切開(kāi)行股靜脈穿刺置管，靜脈給阿曲庫(kù)銨維持肌松。頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺置管，監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓、心率、血?dú)獾取１狙芯緾、D兩組大鼠大潮氣量機(jī)械通氣的潮氣量設(shè)為40 ml／kg，這是參考Karzai等的實(shí)驗(yàn)研究并稍作修改。

機(jī)械通氣達(dá)到預(yù)定時(shí)間后，放血處死大鼠。小心分離左右兩側(cè)完整肺組織，部分右側(cè)肺組織用多聚甲醛溶液固定，用于病理切片以及細(xì)胞凋亡檢測(cè)。左肺用生理鹽水行肺灌洗(2 ml×3次)，回收的肺灌洗液應(yīng)大于90％?；厥蘸罅⒓措x心10 min(2500 r／min)，沉淀物用PBS緩沖液稀釋后光鏡下行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，上清液置于-70℃冰箱保存待檢。

1．4檢測(cè)指標(biāo)

對(duì)于肺組織標(biāo)本，具體檢測(cè)各組肺組織病理改變，血管緊張素原基因的表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)肺細(xì)胞的凋亡，同時(shí)檢測(cè)肺濕干重比值以及肺組織中性粒細(xì)胞髓過(guò)氧化物酶(MPO)的水平；對(duì)于肺灌洗液標(biāo)本，具體檢測(cè)肺灌洗液中總蛋白濃度以及白細(xì)胞計(jì)數(shù)的水平。具體方法如下：

(1)肺濕干重(W／D)比值測(cè)定取動(dòng)物一葉右肺組織，稱濕重后置于烤箱中，70℃烘烤至恒重后稱干重，計(jì)算肺W／D比值。

(2)TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的末端標(biāo)記法(TUNEL法)分析肺組織中細(xì)胞凋亡的情況，通過(guò)原位測(cè)定肺組織切片中的DNA片段對(duì)損傷的肺組織中細(xì)胞凋亡的程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。細(xì)胞核呈棕黃色染色為陽(yáng)性細(xì)胞，在400倍光鏡下每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)高倍視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和該高倍視野中細(xì)胞總數(shù)的比值，以百分?jǐn)?shù)表示，即凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。

(3)總蛋白和MPO肺灌洗液中總蛋白的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法，采用UV-2000型分光光度計(jì)測(cè)量吸光度；肺組織中MPO活性測(cè)定采用專(zhuān)用MPO試劑盒，先準(zhǔn)確稱取肺組織重量，按重量體積比用勻漿緩沖液(試劑盒中自備)進(jìn)行勻漿，其后所有步驟均嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行，最后測(cè)量特定波長(zhǎng)下吸光度。MPO活性單位定義為：每克肺組織濕片在37℃反應(yīng)體系中H₂O₂被分解1 μmol為

一個(gè)酶活力單位。

(4)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)肺組織中血管緊張素原(ANG)等基因表達(dá)水平的檢測(cè)采用RT-PCR的方法，具體方法如下：①RNA的提取準(zhǔn)確稱取100 mg肺組織，勻漿后依次加入適當(dāng)體積的Trizol、氯仿、異丙醇、75％乙醇進(jìn)行RNA抽提，確定樣品RNA的質(zhì)量和純度。②RNA逆轉(zhuǎn)錄抽取1 μg總RNA，嚴(yán)格按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒所提供的方法合成cDNA。③PCR PCR反應(yīng)體系包括：cDNA 4 μl，Buffer 5 μl，dNTP l μl，引物的正義鏈和反義鏈各1 μl，MgCl₂₅ 4 μl，Taq酶1 μl，加水至50 μl。內(nèi)參采用管家基因磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)。PCR反應(yīng)設(shè)定如下，先95℃預(yù)變性4～5 min，擴(kuò)增30～35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括如下步驟：①變性94℃時(shí)30 s；②退火：55℃時(shí)30 s(GAPDH)，60℃時(shí)30 s(ANG)；③延伸72℃時(shí)45s，最后72℃延伸7～10 min，4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用圖像分析軟件(]magemaster)分析目的基因片段OD值。ANG特異引物為，正義鏈：5CCTCGCTCTCTGGACTFATC 3，反義鏈：5CAGACACTGAGGTGC TGT TG 3，目的基因片段長(zhǎng)度為226 bp；GAPDH特異性的引物為，正義鏈：5TGAAGGTCGGTGTCAACGGATITGGC 3，反義鏈：5CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC 3，目的基因片段長(zhǎng)度為983 bp。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

測(cè)定值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)，用SPSS 10.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，組問(wèn)兩兩比較采用LSD-τ檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1病理學(xué)改變

A組為正常肺組織病理圖片；B組肺組織病理基本正常，肺泡間隔正常，偶見(jiàn)少量的炎性細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞，肺泡腔無(wú)滲出物；C組肺組織出現(xiàn)明顯的炎性損傷性改變，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡腔內(nèi)有滲出液；和C組比較，D組肺組織病理改變明顯減輕，肺泡間隔一定程度增厚，但輕于C組，肺泡腔可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡腔有少量滲出物。

2．2RT－PCR檢測(cè)血管緊張素原(ANG)基因的表達(dá)

ANG表達(dá)水平以ANG／GAPDH光密度比值表示。與A組(0.17±0.04)比較，B組ANG基因的表達(dá)水平(0.19±0.06)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與B組比較，C組ANG基因的表達(dá)水平(0.65±0.16)顯著增高(P＜0.01)。

2．3TUNEL檢測(cè)肺細(xì)胞的凋亡

A組肺組織有少量肺細(xì)胞凋亡；與A組相比，B組肺組織細(xì)胞凋亡數(shù)目差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與A、B組相比，C組細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著性增加(P＜0.01)；與C組相比，D組肺細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著性降低(P＜0.01)。

與A、B組相比，C組肺灌洗液(肺組織)中總蛋白、總細(xì)胞計(jì)數(shù)、MPO、肺濕干重(W／D)比值、凋亡指數(shù)(AI)等指標(biāo)顯著性增高(P＜0.01)；與c組比較，D組上述各項(xiàng)指標(biāo)均顯著性降低(P＜0.05)；A、B兩組上述各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

機(jī)械通氣所致的肺損傷(VILI)致病機(jī)制非常復(fù)雜，包括機(jī)械傷和生物傷等。前者是指高氣道壓力或高容積等機(jī)械刺激造成肺泡、肺毛細(xì)血管壁破裂及肺彌漫性水腫等損傷；而生物傷是指肺部急性炎性損傷，是目前研究的熱點(diǎn)，指過(guò)度的機(jī)械刺激(如牽拉、切變力等)激活了肺細(xì)胞內(nèi)多種與炎癥密切相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如p38MAPK、JNKs以及NF-kB系統(tǒng)等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，使各種致炎因子的表達(dá)顯著增多，引起白細(xì)胞(特別是中性粒細(xì)胞)在肺組織“募集”，從而造成肺的急性炎性損傷。血管緊張素Ⅱ是一種具有血管收縮作用的多肽，其受體主要分為兩型，即ATl和AT2型，血管緊張素Ⅱ主要通過(guò)ATl受體發(fā)揮作用。血管緊張素Ⅱ不僅調(diào)節(jié)血管的收縮，還在血管的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。研究證明，血管緊張素Ⅱ通過(guò)激活A(yù)Tl受體，可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞上多種和炎癥相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如p38MAPK、JNKs以及NF-kB系統(tǒng)等。血管緊張素Ⅱ通過(guò)激活A(yù)Tl受體，可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞內(nèi)多種炎性細(xì)胞因子、黏附分子以及趨化因子的表達(dá)。血管緊張素Ⅱ及其受體不僅廣泛存在于心血管系統(tǒng)，還分布于肺組織細(xì)胞。研究表明，除了在血管炎性反應(yīng)中起著重要的作用外，血管緊張素Ⅱ及其受體可能還在各種急性肺損傷中起著重要的作用。動(dòng)物研究表明，在多種原因所致的急性肺損傷中，肺組織中血管緊張素Ⅱ的表達(dá)水平均顯著增高，而阻斷血管緊張素Ⅱ受體或減少血管緊張素Ⅱ的生成可以減輕多種原因所致的急性肺損傷，抑制中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，減輕肺水腫程度。目前，有關(guān)血管緊張素Ⅱ及其受體在VILI中的作用還很少有人研究。因此，在本研究中筆者建立了大鼠VILI實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以血管緊張素原的表達(dá)(血管緊張素Ⅱ的前體)來(lái)問(wèn)接反映血管緊張素Ⅱ的水平，用血管緊張素Ⅱ受體(ATl型)阻斷劑洛沙坦(Losartan)預(yù)處理VILI的大鼠，研究血管緊張素Ⅱ在VILI中的作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，與A、B兩組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明與A組相比，正常潮氣量機(jī)械通氣并沒(méi)有產(chǎn)生急性肺損傷。與A組、B組相比，C組大鼠肺病理改變明顯，可見(jiàn)肺間隔增厚，肺泡腔較多的白細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡間隔斷裂，偶有肺大泡形成；C組細(xì)胞凋亡數(shù)量、肺濕／干比、總蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、MPO等指標(biāo)均顯著性增高。MPO是中性粒細(xì)胞釋放的一種過(guò)氧化物酶類(lèi)，和中性粒細(xì)胞的數(shù)目存在極顯著的相關(guān)性，可反映肺組織中性粒細(xì)胞浸入的水平。這說(shuō)明C組大潮氣量機(jī)械通氣產(chǎn)生了明顯的肺損傷，即VILI，表現(xiàn)為肺水腫、白細(xì)胞(特別是中性粒細(xì)胞)的浸潤(rùn)以及肺上皮細(xì)胞的凋亡等。另外，在本實(shí)驗(yàn)中，A、B組相比，C組大鼠肺組織中血管緊張素原的基因表達(dá)水平顯著性增高，表明大潮氣量機(jī)械通氣明顯上調(diào)了肺細(xì)胞血管緊張素原的表達(dá)，間接說(shuō)明VILI時(shí)血管緊張素Ⅱ的表達(dá)顯著增高。在本研究中，D組行大潮氣量機(jī)械通氣之前用ATl受體阻斷劑Losartan預(yù)處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與C組相比，D組細(xì)胞凋亡數(shù)量、肺濕／干比、總蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、MPO等指標(biāo)均顯著性降低。表明Losartan顯著減輕了VILI時(shí)急性肺損傷的程度和炎癥反應(yīng)的水平。

作為ATl受體特異性阻斷劑，Losartan對(duì)大鼠VILI的保護(hù)作用可能和阻斷血管緊張素Ⅱ的作用有關(guān)。血管緊張素Ⅱ最初發(fā)現(xiàn)時(shí)被作為一種具有血管收縮作用的多肽，但近些年的研究表明血管緊張素Ⅱ具有多方面的作用。如上所述，血管緊張素Ⅱ可通過(guò)激活血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞上的ATl受體從而激活多種和炎癥相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)多種致炎因子的產(chǎn)生。盡管這些細(xì)胞學(xué)的研究多和血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞相關(guān)，但肺的血管內(nèi)皮細(xì)胞本身就在各種急性肺損傷(包括VILI)的致病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。當(dāng)然，血管緊張素Ⅱ及其受體是否在肺上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用還需更進(jìn)一步研究。除了炎癥反應(yīng)外，血管緊張素Ⅱ還在氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ能促進(jìn)白細(xì)胞等的氧化應(yīng)激反應(yīng)，加重炎性損傷。Wang等研究表明，血管緊張素Ⅱ還可誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞等的凋亡。因此，Losartan對(duì)VILI的保護(hù)作用可能還和其阻斷血管緊張素Ⅱ的促進(jìn)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡作用有關(guān)。總之，血管緊張素Ⅱ在炎癥、細(xì)胞凋亡以及氧化應(yīng)激反應(yīng)等多方面均起著一定的作用，Losartan對(duì)VILI的保護(hù)作用可能與上述這些方面有一定聯(lián)系。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，VILI時(shí)血管緊張素Ⅱ的表達(dá)水平顯著增高，特異性阻斷ATl受體能顯著減輕VILI時(shí)急性肺損傷的程度。