鹽酸戊乙奎醚對(duì)大鼠腦缺血－再灌流損傷的保護(hù)作用

許　鐵　龐　濤　縱雪梅　梁高永　王志萍　耿德勤　燕憲亮　王厚清

【摘要】目的探討鹽酸戊乙奎醚對(duì)大鼠三動(dòng)脈阻斷法急性全腦缺血-再灌流損傷的保護(hù)作用。方法144只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血一再灌流組(生理鹽水1 md)、東莨菪堿組(0.01mg／kg)和鹽酸戊乙奎醚組(0.01 mg／kg)，缺血前40 min分別腹腔注射相應(yīng)藥物，缺血時(shí)間為10min，于再灌流24 h、3 d和7 d測(cè)定其行為學(xué)(開(kāi)闊法、平衡木法、攀繩和肌力試驗(yàn))，再灌流2 h、12 h、24 h、3 d和7 d取材測(cè)定海馬CAl區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)量(HE染色)、凋亡神經(jīng)元數(shù)量(TUNEL染色)、bcl-2和bax蛋白表達(dá)(免疫組化染色)，部分大鼠于再灌流4 d測(cè)定腦梗死體積(TFC法)。結(jié)果與缺血．再灌流組比較，鹽酸戊乙奎醚組和東莨菪堿組海馬CAl區(qū)凋亡神經(jīng)元數(shù)量減少(P＜0.01)，bcl-2提前并延長(zhǎng)表達(dá)(P＜0.01)，鹽酸戊乙奎醚組bax表達(dá)下降(P＜0.05或P＜0.01)。同時(shí)，鹽酸戊乙奎醚組和東莨菪堿組存活神經(jīng)元數(shù)量增加(P＜0.05)，腦梗死體積縮小(P＜0.05或P＜0.01)，行為學(xué)檢測(cè)指標(biāo)改善(P＜0.05)。鹽酸戊乙奎醚組較東莨菪堿組作用更加明顯(P＜0.05)。結(jié)論鹽酸戊乙奎醚對(duì)腦缺血一再灌流損傷大鼠具有腦保護(hù)作用，并且優(yōu)于同樣劑量東莨菪堿。改變bcl-2／bax的比例可能是其機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】鹽酸戊乙奎醚；腦缺血-再灌流損傷；細(xì)胞凋亡；Bcl-2；Bax；大鼠

乙酰膽堿(Ach)是腦內(nèi)經(jīng)典的興奮性遞質(zhì)，作用于M型和N型膽堿受體，與大腦的多種高級(jí)神經(jīng)功能有關(guān)。腦缺血時(shí)Ach釋放異常增加。研究表明Ach可通過(guò)M型膽堿受體加強(qiáng)谷氨酸(Glu)誘導(dǎo)的培養(yǎng)海馬神經(jīng)元變性。腦內(nèi)突觸前N型膽堿受體激活后也能夠增加包括Glu在內(nèi)的多種遞質(zhì)的釋放。Glu和Ach可能在缺血性腦損傷中有放大的協(xié)同作用。鹽酸戊乙奎醚是一種新型抗膽堿藥物，具有中樞及外周的抗毒蕈堿(M)和抗煙堿(N)樣作用，本實(shí)驗(yàn)選用鹽酸戊乙奎醚為研究藥，以東莨菪堿為陽(yáng)性對(duì)照藥，通過(guò)觀察腦缺血．再灌流損傷大鼠的行為學(xué)指標(biāo)、腦梗死體積和神經(jīng)元凋亡的變化，探討該藥的腦保護(hù)作用及其機(jī)制。

1材料與方法

1．1動(dòng)物分組及模型制備

雄性SD大鼠144只(體重200～250 g)，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血．再灌流組(I／R組)、東莨菪堿組(sco組)和鹽酸戊乙奎醚組(PH組)，每組再繼續(xù)分為2 h、12 h、24 h、3 d、4 d及7 d共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)(各時(shí)間點(diǎn)n=6)。采用三動(dòng)脈阻斷法全腦缺血模型。缺血時(shí)間為10 min。Sham組僅游離基底動(dòng)脈和雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不阻斷。其余三組分別于缺血前40 min，用生理鹽水1 ml(I／R組)、東莨菪堿0.01 mg／kg(Sco組)和鹽酸戊乙奎醚0.01 mg／kg(PH組)注射于腹腔。實(shí)驗(yàn)中維持動(dòng)物鼓膜溫度在(37.0±0.2)℃至再灌流后2 h。

1．2行為學(xué)測(cè)定

分別于再灌流24 h、3 d和7 d用開(kāi)闊法、平衡木法、攀繩和肌力試驗(yàn)測(cè)定大鼠行為學(xué)變化。

1．3海馬CAl區(qū)錐體細(xì)胞計(jì)數(shù)

分別于再灌流后2 h、12 h、24 h、3 d和7 d灌注取材，制備冠狀連續(xù)石蠟切片。取背側(cè)海馬中部切片，進(jìn)行HE染色(存活細(xì)胞)、bcl-2和bax免疫組織化學(xué)染色(陽(yáng)性細(xì)胞)以及TUNEL染色(凋亡細(xì)胞)。光鏡下分別計(jì)算各切片雙側(cè)海馬CAl區(qū)中段1 mm錐體細(xì)胞數(shù)目，取平均值進(jìn)行組間比較。

1．4腦梗死體積測(cè)定

再灌流4 d，快速斷頭取腦，冷凍后由額極向嗅束基底部行連續(xù)冠狀切片(2 mm)。以TYC染色法計(jì)算前腦體積和梗死體積。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，應(yīng)用SPSS 12．0統(tǒng)計(jì)軟件處理。組間比較行為學(xué)評(píng)分采用秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis Test，兩兩比較應(yīng)用擴(kuò)展t檢驗(yàn)法)，其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(PostHoc Tests，兩兩比較應(yīng)用Scheffe法)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1行為學(xué)測(cè)定結(jié)果

再灌流后大鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)減少，平衡木和攀繩積分下降，懸掛時(shí)間縮短。再灌流3 d，Sco組和PH組均較I／R組改善(P＜0.05)；PH組較Sco組懸掛時(shí)間延長(zhǎng)(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2．2海馬CAl區(qū)錐體細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

2．2．1HE染色再灌流24 h，I／R組、Sco組和PH組錐體細(xì)胞數(shù)目較Sham組減少，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而加劇(P＜0.01)；與I／R組比較，Sco組錐體細(xì)胞數(shù)目增加(P＜0.05)，PH組增加更為明顯(P＜0.01)。見(jiàn)表2。

2．2．2免疫組織化學(xué)染色再灌流12 h，I／R組、Sco組和PH組bel-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較Sham組開(kāi)始增加(P＜0.01)，I／R組在24 h達(dá)到高峰；Sco組和PH組均在12 h達(dá)到高峰且持續(xù)高表達(dá)至24 h。再灌流4 h，PH組bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較I／R組減少(P＜0.05)，并持續(xù)至3 d(P＜0.01)。見(jiàn)表2。

2．2．3 TUNEL染色再灌流3 d，Sco組和PH組凋亡細(xì)胞數(shù)目較I／R組減少(P＜0.01)，PH組較Sco組減少(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2．3腦梗死體積測(cè)定結(jié)果

再灌流4 d梗死灶主要出現(xiàn)于頂顳區(qū)皮質(zhì)、海馬和紋狀體區(qū)。與I／R組相比，Sco組梗死體積和梗死體積百分比縮小(P＜0.05)，PH組縮小更為明顯(P＜0.01)。見(jiàn)表3。

3討論

壞死和凋亡是腦缺血．再灌流損傷的主要形式，壞死位于缺血梗死灶的核心區(qū)，而凋亡常分布于邊緣區(qū)半暗帶內(nèi)。細(xì)胞凋亡參與梗死灶的發(fā)展，可能最終決定腦梗死體積。目前認(rèn)為bel-2家族成員bax和bel-2是與腦缺血神經(jīng)元凋亡關(guān)系最密切的調(diào)控基因，bcl-2通過(guò)和bax形成異源二聚體，發(fā)揮抗凋亡作用。實(shí)驗(yàn)顯示bcl-2過(guò)表達(dá)在缺血一再灌流和持續(xù)缺血這兩種模型中均明顯促進(jìn)神經(jīng)元的存活，bcl-2／bax的比例決定細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)表明，SD大鼠全腦缺血-再灌流可引起海馬CAl區(qū)錐體細(xì)胞壞死并誘發(fā)神經(jīng)元凋亡。使用鹽酸戊乙奎醚可促使海馬CAl區(qū)bcl-2提前并延長(zhǎng)表達(dá)，同時(shí)抑制bax的表達(dá)，減少了凋亡神經(jīng)元數(shù)目，縮小了腦梗死體積并且改善了行為學(xué)檢測(cè)指標(biāo)。從上述眾多指標(biāo)變化的時(shí)間順序上推斷，該藥可能通過(guò)改變bcl-2和bax的表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用。

鹽酸戊乙奎醚選擇性作用于M₁和M₃亞型受體，避免了對(duì)心臟的毒副作用和由于阻斷突觸前膜M₂亞型受體而導(dǎo)致的不良反應(yīng)。該藥對(duì)N₁和N₁亞型受體也有阻斷作用，本研究也顯示，鹽酸戊乙奎醚的腦保護(hù)作用較東莨菪堿更加明顯，推測(cè)可能與其同時(shí)阻斷N受體有關(guān)。與傳統(tǒng)M膽堿受體阻滯劑相比，鹽酸戊乙奎醚具有起效快，抗膽堿作用強(qiáng)，半衰期長(zhǎng)(10.5 h)及毒副作用少等優(yōu)點(diǎn)。但有關(guān)該藥的腦保護(hù)作用的報(bào)道不多。本研究為鹽酸戊乙奎醚在腦缺血和腦復(fù)蘇中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。