丁草胺降解菌的分離優(yōu)化

國(guó)增超

（齊魯醫(yī)藥學(xué)院生化教研室 山東淄博 255213）

丁草胺降解菌的分離優(yōu)化

國(guó)增超

（齊魯醫(yī)藥學(xué)院生化教研室 山東淄博 255213）

通過(guò)富集、馴化培養(yǎng)及平板劃線(xiàn)等微生物分離技術(shù)，從長(zhǎng)期生產(chǎn)丁草胺的山東省某農(nóng)藥廠(chǎng)附近的土壤中分離得到了三株以丁草胺為唯一碳源或氮源的降解菌株，分別標(biāo)記為SD-1、SD-2和SD-3。通過(guò)革蘭氏染色可以判斷，SD-1被染成藍(lán)紫色為革蘭氏陽(yáng)性球菌，SD-2被染成藍(lán)紫色為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，SD-3被染成紅色為革蘭氏陰性桿菌.隨后，通過(guò)糖發(fā)酵及IMVIC等生理生化實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株的基本生理生化特征進(jìn)行了鑒定.同時(shí)，通過(guò)單因子優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定了三株丁草胺降解菌的最適生長(zhǎng)溫度均為28℃，最適pH均為7.0，所需的最適丁草胺濃度SD-1為100 mmol/L，SD-2和SD-3均為300 mmol/L.

丁草胺 生物降解 富集 分離

丁草胺是一種高效內(nèi)吸傳導(dǎo)型苯乙酰胺類(lèi)除草劑，尤其是對(duì)禾本科雜草有較好的除草效果，因其具有殺草活性高、選擇性強(qiáng)、用量少等優(yōu)點(diǎn)，丁草胺及其復(fù)配制劑每年均大量生產(chǎn)，已逐步成為我國(guó)用量最大的除草劑之一［1］。

但是丁草胺在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的同時(shí)，不可避免的在植株、土壤和水體等系統(tǒng)中殘留，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。其不僅對(duì)光合細(xì)菌、固氮細(xì)菌等微生物的生長(zhǎng)有抑制作用［2-3］，破壞了生態(tài)系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，而且嚴(yán)重影響了農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量和人們的身體健康。陳小軍［4］等針對(duì)丁草胺在水稻上的降解動(dòng)態(tài)與殘留情況進(jìn)行了分析研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在水稻田以常規(guī)劑量2.571g/hm2和高劑量3.857g/ hm2施用35%丁·芐可濕性粉劑后，水稻植株中的殘留量為0.1738～0.2230mg/kg，在稻米中的殘留量為0。0154～0.0342 mg/kg，在米糠中的殘留量為0.0107～0.0297mg/kg。雖然檢測(cè)中的丁草胺含量均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，但是隨著丁草胺用量的日益擴(kuò)大，丁草胺在生態(tài)環(huán)境中的安全問(wèn)題逐漸引起了人們的關(guān)注［5-10］。

土壤和水環(huán)境中的丁草胺可以通過(guò)光解的方式進(jìn)行降解。但是，有研究表明，丁草胺抗光解的性能比較好［11］，并且其在土壤中的光解速率和深度隨土壤和水體pH值的增大而加快［6］，這樣在對(duì)丁草胺進(jìn)行降解的同時(shí)，也破壞了水體和土壤的酸堿平衡。與光解相比，微生物代謝在除草劑降解中具有投資少、處理效率高、運(yùn)行成本低、無(wú)二次污染等優(yōu)勢(shì)。因此，針對(duì)殘留丁草胺的處理降解目前主要集中在微生物降解研究上。趙淑莉等［13］用高效液相色譜對(duì)除草劑丁草胺在水溶液中的微生物降解進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，接種微生物后丁草胺的降解速率明顯加快，說(shuō)明微生物是丁草胺降解的主要因素。李春艷等［14］用富集培養(yǎng)技術(shù)從長(zhǎng)期施用丁草胺的稻田土壤中分離得到1株能夠降解丁草胺的細(xì)菌，并對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，可使丁草胺降解率達(dá)90.85%以上。

本研究以長(zhǎng)期生產(chǎn)丁草胺的山東省某農(nóng)藥生產(chǎn)廠(chǎng)附近的污水及土壤為材料，對(duì)丁草胺降解菌進(jìn)行了分離優(yōu)化，并對(duì)其生理生化特征進(jìn)行了初步研究，擬在為丁草胺的降解提供優(yōu)良菌株資源，對(duì)丁草胺污染土壤的生物修復(fù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

表1 革蘭氏染色結(jié)果Table 1 Gram stain results

表2 生理生化特征Table 2 characteristics of physiological and biochemical

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從生產(chǎn)丁草胺的山東省某農(nóng)藥廠(chǎng)附近采集的土壤作為樣品。

土壤的理化性質(zhì)：堿性，有刺激性氣味，顆粒狀黑色，溶于水后分上、中、下三層。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：蛋白胨1.0g，葡萄糖5.0g，K2HPO4 1.0g，KH2PO4 1.0g，NaCl 2.5g，加去離子水至1000ml，pH調(diào)至7.0，121℃，滅菌30min。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：MgSO4 0.5g，F(xiàn)eSO4 0.018g，K2HPO4 1. 31g，NaNO3 3.0g，

KCL 0.5g，加去離子水至1000ml，pH調(diào)至7。0，121℃，滅菌30min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0g，蛋白胨1.0g，瓊脂粉20g，NaCl 2.5g，

加去離子水至1000ml，pH調(diào)至7.2，121℃，滅菌30min。

糖發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨2.0g，葡萄糖10。0g，溴百里酚藍(lán)3ml，NaCl 5.0g

K2HPO4 0.2g，加去離子水至1000ml，pH調(diào)至7.2，121℃，滅菌30min。

蛋白胨水培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0g，pH調(diào)至7.4，121℃，滅菌30min。

葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基：葡萄糖10.0g，蛋白胨10.0g，加去離子水至1000ml，pH調(diào)至7.2，121℃，滅菌30min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的富集與分離

取10g土樣溶于1000ml蒸餾水中，混勻，從上、中、下三層各取10ml樣品分別接入100ml的富集培養(yǎng)基中。在28℃下?lián)u床培養(yǎng)4d左右后取出，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基變渾濁，再將上述培養(yǎng)液各取10ml加入到含有丁草胺的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在28℃下?lián)u床培養(yǎng)，然后每隔7天接入新鮮的含丁草胺的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基并逐步提高丁草胺的濃度，如此進(jìn)行馴化富集培養(yǎng)約2個(gè)月。然后分別取培養(yǎng)液接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，挑取生長(zhǎng)較好的菌落回接于含有丁草胺的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，待溶液出現(xiàn)渾濁，接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待出現(xiàn)菌落后，各挑取一株生長(zhǎng)速度快，比較大的菌落進(jìn)行劃線(xiàn)分離，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表3 pH對(duì)丁草胺降解菌的影響Table 3 the impact of pH

表4 溫度對(duì)丁草胺降解菌的影響Table 4 the impact of temperature

表5 丁草胺濃度對(duì)丁草胺降解菌的影響Table 5 the impact of butachlor concentration

1.3.2 革蘭氏染色

對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，其中染成紅色的為革蘭氏陰性菌，染成藍(lán)紫色的為陽(yáng)性菌，在顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察。

1.3.3 純化菌株的生理生化特征鑒定［15］

糖發(fā)酵試驗(yàn)

此實(shí)驗(yàn)利用細(xì)菌分解糖的產(chǎn)物不同進(jìn)行菌株的鑒定。有的細(xì)菌分解糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的細(xì)菌分解糖只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

將分離純化的三株丁草胺降解菌分別接種于含有糖發(fā)酵培養(yǎng)基的三只試管中，再取一個(gè)只含有糖發(fā)酵培養(yǎng)基而不接種任何菌株的試管和一個(gè)已接種了大腸桿菌且含有糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管分別作為對(duì)照和比較，在上述試管中分別放入一個(gè)裝滿(mǎn)培養(yǎng)液的小試管。將上述裝置放于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，觀(guān)察并記錄結(jié)果。

吲哚試驗(yàn)

含有色氨酸酶的細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，吲哚與對(duì)二甲基苯甲醛結(jié)合形成紅色化合物。

將分離純化的三株丁草胺降解菌分別接種于含有蛋白胨水培養(yǎng)基的三只試管中，再取一個(gè)只含有蛋白胨水培養(yǎng)基而不接種任何菌株的試管和一個(gè)已接種了大腸桿菌且含有蛋白胨水培養(yǎng)基的試管分別作為對(duì)照和比較。將上述裝置放于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，取出后加入乙醚并充分振蕩，使吲哚溶于乙醚中，然后慢慢加入吲哚試劑5滴，觀(guān)察有無(wú)玫瑰紅色出現(xiàn)。

伏普試驗(yàn)

有些細(xì)菌可利用葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧變成乙酰甲基甲醇，此物再堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰，二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基作用生成紅色化合物。

將分離純化的三株丁草胺降解菌分別接種于含有葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的三只試管中，再取一個(gè)只含有葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基而不接種任何菌株的試管和一個(gè)已接種了大腸桿菌且含有葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的試管分別作為對(duì)照和比較。將上述裝置放于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d。

1.3.4 單因子優(yōu)化試驗(yàn)測(cè)丁草胺降解菌的最適生長(zhǎng)條件

pH對(duì)丁草胺降解菌的影響

將三株丁草胺降解菌等量稀釋并接種于pH分別為6，7，8，9，丁草胺濃度為100mmol/L的選擇培養(yǎng)基中，在28℃震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，然后分別去1ml培養(yǎng)液稀釋10倍后，取1ml稀釋液涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。計(jì)算各培養(yǎng)皿中單菌落數(shù)。

溫度對(duì)丁草胺降解菌的影響

將三株丁草胺降解菌等量稀釋并接種于pH為7，丁草胺濃度為100mmol/L的選擇培養(yǎng)基中，分別在15℃、20℃、28℃、33℃的震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，然后分別取1ml培養(yǎng)液稀釋10倍后，取1ml稀釋液涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。計(jì)算各培養(yǎng)皿中單菌落數(shù)。

丁草胺濃度對(duì)其降解菌生長(zhǎng)的影響

將三株丁草胺降解菌等量稀釋并接種于pH為7，丁草胺濃度分別為50 mmol/L 、100mmol/L、300mmol/L、500mmol/L的液體培養(yǎng)基中，分別在20℃、28℃、33℃的震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，然后分別取1ml培養(yǎng)液稀釋10倍后，取1ml稀釋液涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。計(jì)算各培養(yǎng)皿中單菌落數(shù)。

2 結(jié)果及分析

2.1 革蘭氏染色

經(jīng)過(guò)多次分離純化，得到三株以丁草胺為唯一碳源或氮源生長(zhǎng)的菌株，分別標(biāo)記為SD-1、SD-2、SD-3。革蘭氏染色后的結(jié)果如表1所示。SD-1被染成藍(lán)紫色為革蘭氏陽(yáng)性球菌，SD-2被染成藍(lán)紫色為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，SD-3被染成紅色為革蘭氏陰性桿菌。

2.2 生理生化特征鑒定

本實(shí)驗(yàn)對(duì)分離純化的三株菌株的生理生化特征進(jìn)行了鑒定，結(jié)果如表2所示。由實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可知，三株菌株都能利用葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，但是丙酮酸的去路不同。SD-1和SD-3分解葡萄糖產(chǎn)生的丙酮酸通過(guò)脫羧、氧化生成了二乙酰，二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基作用生成紅色化合物；而SD-2分解葡萄糖產(chǎn)生的丙酮酸又進(jìn)一步分解成了甲酸。由吲哚試驗(yàn)可知，SD-1不含色氨酸酶，SD-2與SD-3兩株菌株含色氨酸酶。

2。3 不同因素對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

微生物降解農(nóng)藥的能力與溫度、pH以及農(nóng)藥的濃度都有一定的關(guān)系。因此，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)底物濃度、溫度以及pH對(duì)菌株的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在溫度及底物濃度都恒定的條件下，當(dāng)pH=7時(shí)，三株菌株的數(shù)量最多，生長(zhǎng)最快（表3）。說(shuō)明中性條件是降解菌的最適生長(zhǎng)條件。在pH、底物濃度等都相同的條件下，菌株數(shù)目雖溫度的升高，呈現(xiàn)出先增多后減少的趨勢(shì)，并且當(dāng)溫度為28℃時(shí)，菌株數(shù)目最多（表4）。因此，降解菌最適宜的生長(zhǎng)溫度在28℃左右。進(jìn)一步對(duì)底物濃度的研究發(fā)現(xiàn)（表5），當(dāng)丁草胺的濃度為100mmol/L時(shí)，SD-1的數(shù)量最多，生長(zhǎng)最快；當(dāng)丁草胺的濃度升高為300mmol/L時(shí)，SD-2和 SD-3的數(shù)量最多。但當(dāng)丁草胺濃度繼續(xù)升高時(shí)，三株菌的數(shù)量均呈下降趨勢(shì)。

3 結(jié)論

丁草胺因其殺草活性高，選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，已逐漸成為我國(guó)用量最多的三大除草劑之一［16］。目前，國(guó)外所報(bào)告的對(duì)丁草胺有降解作用的微生物主要有毛霉菌屬、毛殼球菌、青霉菌屬等［18］，但我國(guó)關(guān)于丁草胺降解菌的報(bào)道較少，主要有節(jié)桿菌屬等［8］。本研究通過(guò)富集、馴化培養(yǎng)等微生物分離技術(shù)，從長(zhǎng)期生產(chǎn)丁草胺的山東省某農(nóng)藥廠(chǎng)附近的土壤中分離得到了三株以丁草胺為唯一碳源或氮源的降解菌株。通常情況下，微生物降解農(nóng)藥的能力與濃度、pH及溫度等都有一定的關(guān)系，在自然環(huán)境中的降解能力還會(huì)受到其他微生物的影響。本研究通過(guò)單因子優(yōu)化實(shí)驗(yàn)對(duì)三株丁草胺降解菌所需的最適丁草胺濃度、最適pH及最適溫度等進(jìn)行了確定。中性條件以及溫度在28℃左右時(shí)，三株降解菌的生長(zhǎng)力最強(qiáng)；SD-1最適宜生長(zhǎng)的丁草胺濃度為100mmol/L，而SD-2和 SD-3最適宜的丁草胺濃度為300mmol/L，但當(dāng)丁草胺濃度繼續(xù)升高時(shí)，三株菌的數(shù)量均呈下降趨勢(shì)。

本研究所進(jìn)行的單因子優(yōu)化實(shí)驗(yàn)等操作是在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行的，菌株是否能夠在田間自然環(huán)境下對(duì)土壤中的丁草胺進(jìn)行降解以及降解率如何則需要將菌株接種到污染土壤中實(shí)際測(cè)定其修復(fù)能力［19-21］。另外，后續(xù)研究還將進(jìn)一步對(duì)菌株的16srRNA基因序列進(jìn)行分析，以準(zhǔn)確確定菌株所屬種屬，并進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行降解率的研究。

［1］吳新杰，岳永德，花日茂，等.丁草胺高效降解細(xì)菌的分離［J］. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2000，6（6）：593-596.

［2］Zager M Y. Effects of benthiocarb and butachlor on growth and nitrogen fixation by cyanobacteria ［J］.Bull Environ Contam Toxicol， 1990， 45（2）：232-234.

［3］Lee K M. Effects of butachlor on the growth of purplenon sulfur bacteria［J］. Misaengmul Hakhoechi，1991，29（2）：130-135.

［4］陳小軍，程?hào)|美，徐漢虹，等.丁草胺在水稻上的降解動(dòng)態(tài)與殘留分析［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28（3）：286-290.

［5］馮慧敏，何紅波，武葉葉，等.黑土環(huán)境中乙草胺的微生物降解特征研究［J］.土壤通報(bào)，2008，39（2）：379-343.

［6］鄭和輝，葉常明.甲草胺和丁草胺等除草劑在多介質(zhì)環(huán)境中環(huán)境行為綜述［J］.環(huán)境科學(xué)進(jìn)展，1999，7（3）：1-10.

［7］李川，古國(guó)榜，柳松.丁草胺高效真菌的分離及性能研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，23（3）：611-614.

［8］田芹，周志強(qiáng)，江樹(shù)人，等.丁草胺在環(huán)境中降解行為的研究進(jìn)展［J］.農(nóng)藥，2004，43（5）：205-208.

［9］ Zheng H， Ye C. Photodegration of acetochlor and butachlor in waters containing humic acid and inorganic ion ［J］. Bull Environ ContamToxicol， 2001， 67： 601-608.

［10］ Yu Y L， Chen Y X， Luo Y M. Rapid degradation of butachlor in wheat rhizosphere soil ［J］. Chemosphere， 2003， 50： 771-774.

［11］楚小強(qiáng)，龐國(guó)輝，方華，等.丁草胺降解菌的分離鑒定及降解特性的研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28（1）：145-150.

［12］趙淑莉，譚文捷，何緒文.除草劑丁草胺的分析測(cè)定及其微生物降解產(chǎn)物研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，24（5）：989-993.

［13］李春艷，李艷春，成小松，等.一株丁草胺降解菌的分離鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（2）：347-353.

［14］東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，2001：267-273.

［15］胡笑形.我國(guó)農(nóng)藥工業(yè)的現(xiàn)狀與發(fā)展方向［J］.農(nóng)藥，1998，37（6）：7-10.

［16］Cheng H R， Jiang N. Extremely rapid extraction of DNA from bacteria and yeasts［J］. Biotechnology Letters， 2006， 28： 55-59.

［17］Karen M K， Sherry L H， Douglas C N. Novel， attached， sulfuroxidizing bacteria at shallow hydrothermal ventspossess vacuoles not involved in respiratory nitrate accu-mulation［J］. Appl Environ Microbiol， 2004， 70： 7487-7496.

［18］Hsu K Y， Lin H J， Lin J K， et al. Mutagenicity study of butachlor and its metabolites using salmonella typhimurium［J］. Microbiol Immunol Infect， 2005， 38（6）： 409-416.

［19］Beestman G B， Deming J M. Dissipation of acetanilide herbicides fromsoils ［J］. Agronomy Journal， 1974，66（2）：308-311.

Isolation and optimization of Butachlor Degradation Bacteria

GUO Zeng-chao
（Department of Biochemistry， Qilu Medical University， Zibo， Shandong， 255213）

Three butachlor-degrading strains named SD-1， SD-2 and SD-3 were isolated from the soil samples that obtained from the pesticide factory by enrichment culture， domestication selection and plate streaking. SD-1and SD-2 were dyed blueviolet， while the SD-3 was dyed red by the Gram stain. According to the Carbohydrate and IMVIC experiment， the morphologic and physiobiochemical characteristics of the bacteria were identified. Then， by the single factor optimize experiment， the optimal temperature of the three strains were 28℃ and the optimal pH were 7， the optimal butachlor density of the SD-1 was 100mmol/ L， while the SD-2 and SD-3 were 300 mmol/L.

Butachlor；Biodegradation；Enrichment；Isolation

Q5

A

1674-2060（2016）02-0006-03

國(guó)增超（1987—），男，助教，碩士生，主要從事微生物分離純化方面的研究。