核桃粕中環(huán)烯醚萜苷提取分離與抗疲勞活性研究

金 蒙 徐德平 詹 積 陳 晨

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

核桃(JuglansregiaL)又名胡桃、羌桃、合桃等，系胡桃科植物胡桃的干燥果實(shí)[1]，含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等多種成分[2-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究[4-8]表明，核桃具有健腦益智、降血脂、抗氧化、降血糖、補(bǔ)腎固精、抗疲勞等多種功效。

核桃粕是核桃榨油后的餅粕，富含蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，大多用作飼料，僅少量用于生產(chǎn)核桃蛋白粉等初級(jí)產(chǎn)品，造成資源浪費(fèi)[9]。樊永波等[10]研究表明，影響大鼠學(xué)習(xí)、記憶和抗氧化功能的主要成分存在于核桃粕中。烏蘭等[11]發(fā)現(xiàn)核桃粕中的核桃肽可提高乳酸脫氫酶活性，降低血乳酸和血清尿素氮含量，提高肌糖原儲(chǔ)備量，顯著延長(zhǎng)負(fù)重游泳時(shí)間，具備一定的緩解疲勞的作用。可見對(duì)核桃粕功能成分及作用機(jī)制的研究十分必要。而目前，中國(guó)對(duì)核桃的研究主要集中在對(duì)核桃油脂的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及對(duì)核桃蛋白的提取工藝方面，對(duì)核桃粕功能的研究報(bào)道較少，且均為對(duì)核桃粕粗提取物的功能研究，有關(guān)核桃粕中的功能成分，特別是抗疲勞活性成分目前尚未明確。

本試驗(yàn)對(duì)核桃冷榨粕進(jìn)行提取分離，擬對(duì)核桃提取物的不同萃取物進(jìn)行抗疲勞作用研究，以確定核桃粕中對(duì)補(bǔ)腎固精、抗疲勞的有效成分，以期為核桃粕研究和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

核桃冷榨粕：云南林科院；

無(wú)水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

ICR小白鼠：雄性，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

不銹鋼五谷雜糧磨粉機(jī)：CLF-250型，浙江省溫嶺市創(chuàng)立藥材器械廠；

雙層玻璃提取罐：RAT-100型，無(wú)錫申科儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：R1005型，上海申順生物科技有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHZ-95型，上海丞明儀器設(shè)備有限公司；

恒流泵：SYB106-100型，天津市科器高新技術(shù)公司；

電腦全自動(dòng)部份收集器：DBS-100型，上海滬西分析儀器廠有限公司；

超聲波清洗器：KQ-250B型，昆山市超聲儀器有限公司；

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)：BW-TDW709型，上海軟隆科技發(fā)展有限公司；

核磁共振儀：Avance 500 MHz，德國(guó)Bruker公司；

高壓液相儀：Waters Alliance 1525分離單元，美國(guó)Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 核桃粕提取物與粗分離 稱取核桃粕10 kg，粉碎后過(guò)30目篩，置于100 L提取罐中，按1∶10(g/mL)料液比加入體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇，60 ℃條件下攪拌提取5 h，過(guò)濾取濾液，濾渣重復(fù)提取兩次，合并濾液，減壓濃縮至2 L，即為核桃粕乙醇提取物A，保存?zhèn)溆?。向核桃粕醇提后的濾渣中加入100 L去離子水，并于60 ℃條件下攪拌提取5 h，過(guò)濾，取上清液減壓濃縮至合適體積，即為核桃粕水提物，-18 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

取適量核桃粕乙醇提取物于1 000 mL分液漏斗中，按1∶1體積比加入乙酸乙酯，震蕩混勻靜置，反復(fù)萃取3次，取乙酸乙酯相濃縮至浸膏狀，即得乙酸乙酯萃取物B，在乙酸乙酯萃取殘余物中再按1∶1體積比加入正丁醇，震蕩混勻靜置，萃取3次，取正丁醇相減壓濃縮至浸膏狀，即得正丁醇萃取物C，低溫保存?zhèn)溆谩Ｈ∵m量核桃粕水提物，加入適量無(wú)水乙醇至酒精濃度達(dá)到70%以上，并且不斷攪拌使得濃縮液充分醇沉，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，濾液相經(jīng)減壓濃縮至浸膏，得水提醇溶物D，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 核桃粕不同組分的抗疲勞作用 取3周齡 SPF級(jí)雄性ICR小白鼠50只，體重(16.0±2.0)g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組與A、B、C、D試驗(yàn)組，每組10只。用水溶解各提取物，并對(duì)試驗(yàn)組每日給以劑量1.0 g/kg灌胃，小鼠的灌胃體積為0.1 mL/10 g，空白組給等量正常飲用水，連續(xù)給藥30 d。

(1)小鼠跑臺(tái)試驗(yàn)：給藥前1周，在喂食30 min后對(duì)小鼠進(jìn)行15 min跑步機(jī)適應(yīng)性訓(xùn)練；連續(xù)給藥，第30天給藥后30 min，對(duì)小鼠進(jìn)行體能測(cè)試。小鼠訓(xùn)練和測(cè)試方法如表1，通過(guò)逐漸加大速度和坡度的測(cè)試方案，最后以20 m/min速度使小鼠奔跑直至力竭。若小鼠落入電擊區(qū)，數(shù)次電擊后仍無(wú)法繼續(xù)活動(dòng)即判定力竭，記錄跑步時(shí)間。測(cè)試過(guò)程中，小鼠若因受電擊離開刺激源，在跑帶上繼續(xù)活動(dòng)，此時(shí)通道計(jì)時(shí)累加。用時(shí)到達(dá)2 h后，試驗(yàn)結(jié)束。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物訓(xùn)練及測(cè)試方案?Table 1 Training and measurement plan of laboratory animals

? 10 min之后保持20 m/min速度和10°坡度至結(jié)束。

(2)小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)：根據(jù)文獻(xiàn)[12-13]修改如下：跑臺(tái)試驗(yàn)測(cè)試結(jié)束24 h后，再次給藥，30 min后對(duì)小鼠進(jìn)行負(fù)重游泳試驗(yàn)。將小鼠放入水深 35 cm，水溫(25±1)℃的水箱(50 cm×50 cm×50 cm)，鼠尾負(fù)5%體重的鉛皮，記錄小鼠放入水箱至水浸沒頭部后持續(xù)8 s不能浮出水面的時(shí)間，即力竭時(shí)間。

1.2.3 核桃粕抗疲勞作用組分的分析 利用HPLC對(duì)具有抗疲勞作用的萃取物中化學(xué)組成進(jìn)行分析。色譜條件：色譜柱XBridgeTMC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈—水溶液(40∶60)；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。紫外檢測(cè)器條件203 nm。

1.2.4 抗疲勞活性組分的分離 將具有抗疲勞活性組分的正丁醇萃取物C取出解凍，過(guò)濾，上樣到MCI柱(5 cm×100 cm)，依次用去離子水、體積分?jǐn)?shù)為5%，10%，50%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，流速10 mL/min，用TLC薄層法跟蹤檢測(cè)洗脫液中的成分，并根據(jù)Rf值和顯色反應(yīng)的結(jié)果，分析合并相同組分，得到水洗脫物L(fēng)、5%乙醇洗脫物M和10%乙醇洗脫物N。

1.2.5 抗疲勞活性化合物的化學(xué)鑒定 將得到的抗疲勞活性化合物以氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)為溶劑，四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)行1H NMR、13C NMR等測(cè)定。

1.2.6 單體化合物的抗疲勞作用 取3周齡SPF級(jí)雄性ICR小白鼠20只，體重(16.0±2.0)g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組與試驗(yàn)組，每組10只。試驗(yàn)組給單體化合物Ⅱ以每日劑量0.5 g/kg灌胃，小鼠的灌胃體積為0.1 mL/10 g 只，空白組給等量正常飲用水，連續(xù)給藥21 d 后，記錄小鼠體重變化，并進(jìn)行小鼠跑臺(tái)試驗(yàn)和負(fù)重游泳試驗(yàn)，方法同1.2.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃粕不同組分的抗疲勞作用

由表2可知，各試驗(yàn)組中，核桃粕正丁醇萃取物組C小鼠體重變化最大，跑臺(tái)測(cè)試力竭時(shí)間和負(fù)重游泳力竭時(shí)間均為最佳，抗疲勞效果最顯著，且與對(duì)照小鼠存在顯著性差異(P<0.01)。而A、B、D組小鼠的體重變化、跑臺(tái)測(cè)試力竭時(shí)間和負(fù)重游泳力竭時(shí)間與空白組相比均無(wú)明顯改善，說(shuō)明不含抗疲勞活性成分。由此推斷核桃粕醇提物有抗疲勞作用，且有效成分分布于核桃粕醇提物正丁醇萃取物中，故對(duì)正丁醇萃取物進(jìn)一步分離。

表2不同萃取物對(duì)小鼠體重、跑臺(tái)測(cè)試和負(fù)重游泳的影響?
Table 2Effects of different extracts on body weight,treadmill test and weight-bearing swimming of mice(n=10)

組別體重變化/g跑臺(tái)測(cè)試力竭時(shí)間/s負(fù)重游泳力竭時(shí)間/s對(duì)照12.16±14.0673±22.3835±1.89A組16.41±13.14?92±18.33?52±2.95B組13.37±12.3380±22.4244±2.56C組18.46±11.37?98±21.46?59±2.35D組12.77±11.5779±16.7841±2.66

? * 表示與對(duì)照組比較P<0.05。

2.2 正丁醇萃取物組成成分

核桃粕抗疲勞有效成分存在于乙醇提取物正丁醇萃取物中，對(duì)該萃取物進(jìn)行HPLC分析，圖1為正丁醇萃取物的HPLC圖譜，圖中主要由4個(gè)峰，保留時(shí)間分別為2.008，2.949，3.508，4.405 min，說(shuō)明該部分主要由4種化合物組成。

2.3 抗疲勞作用單體化合物的分離及鑒定

2.3.1 化合物的分離 保留時(shí)間為2.008 min 的化合物由于含量較低，未能分離到單體。其他組分分離結(jié)果：

(1)水洗脫物L(fēng)：將L反復(fù)上ODS-AQ柱(3 cm×100 cm)，用去離子水洗脫，流速10 mL/min，洗脫液用試管收集，TLC法跟蹤檢測(cè)洗脫液中的成分，并根據(jù)Rf值和顯色反應(yīng)的結(jié)果，分析合并相同組分，得到單體化合物Ⅰ，即為圖1中保留值為2.949 min的化合物。

圖1 正丁醇萃取物液相色譜圖
Figure 1 HPLC ofN-butanol extract

(2)5%乙醇洗脫物M：將M反復(fù)上ODS-AQ柱(3 cm×100 cm)，依次用體積分?jǐn)?shù)2%，5%，10%，15%的乙醇溶劑洗脫，流速10 mL/min，自動(dòng)收集器每管20 mL收集洗脫液，用TLC法檢測(cè)其中成分，并據(jù)Rf值和顯色反應(yīng)情況合并相同組分，直至得到單體化合物Ⅱ，即為圖1 中保留值為3.508 min的化合物。

(3)10%乙醇洗脫物N：將N反復(fù)上ODS-A柱(3 cm×100 cm)，用體積分?jǐn)?shù)5%，10%，20%，50%的乙醇溶劑洗脫，流速8 mL/min，洗脫液用試管收集，TLC法檢測(cè)其成分，并根據(jù)結(jié)果將相同組分合并，直至得到單體化合物Ⅲ，即為圖1中保留值為4.405 min的化合物。

2.3.2 結(jié)構(gòu)鑒定 有抗疲勞活性組分的正丁醇萃取物經(jīng)ODS-AQ、ODS-A柱層析分離得到3個(gè)化合物，經(jīng) TLC法顯色可見化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的單一斑點(diǎn)，均為單一化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)分別為：

(1)化合物Ⅰ：無(wú)定形粉沫，易溶于水，微溶于乙醇、甲醇。

從1H-NMR(500 MHz，D2O)可見：δ4.61(1H，d，J=1.2)應(yīng)為糖上的端基H-1信號(hào)，δ3.3～3.8為糖上的其余H信號(hào)，δ1.09有1個(gè)三峰甲基信號(hào)，表明化合物為糖的衍生物；從13C-NMR可見：δ103.5，76.7，74.0，72.1，70.5，61.8，61.3，15.3共8個(gè)碳信號(hào)，經(jīng)文獻(xiàn)[14]對(duì)比，該化合物為α-乙氧基半乳糖苷。

(2)化合物Ⅱ：無(wú)定形粉沫，易溶于水、乙醇、甲醇。其1H-NMR(500 MHz，D2O)和13C-NMR圖譜見圖2，由圖譜可見其無(wú)雜峰，為單一化合物。

從圖2(a)可見：δ7.2(1H，s)；δ5.9(1H，s)；δ5.5(1H，s)；δ5.4(1H，d，J=6.0)；δ4.3(2H，dd，J=19.5,43.5)；δ3.9(1H，d，J=15.5)；δ3.7(1H，dd，J=7.0,15.5)；δ3.5(3H，m)；δ3.3(2H，m)；δ3.2(1H，t，J=6.0)。

綜合分析并與文獻(xiàn)[15]對(duì)比，該化合物為環(huán)戊烯型環(huán)烯醚萜苷類化合物，結(jié)構(gòu)為：4-羧基-7-羥基-8-乙酸乙酯基-3,6-環(huán)戊烯環(huán)烯醚萜苷，為首次從核桃粕中分離出的物質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖3所示。

(3)化合物Ⅲ：白色無(wú)定形粉沫，易溶于水，可溶于乙醇、甲醇。從1H-NMR(500 MHz，D2O)可見：6.41(1H，d，J=8.0)，6.31(1H，d，J=8.0)，6.29(1H，d，J=8.0)；從13C-NMR 可見：δ146.6，133.4，118.9，107.6共4個(gè)碳信號(hào)，經(jīng)文獻(xiàn)[14]對(duì)比，該化合物為尿嘧啶。

圖2 化合物Ⅱ的1H-NMR和13C-NMR圖譜Figure 2 1H-NMR and 13C-NMR of Ⅱ

圖3 化合物Ⅱ的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 3 The chemical structures of compounds Ⅱ

2.4 單體化合物的抗疲勞作用

化合物Ⅰ、Ⅲ未有文獻(xiàn)報(bào)道其具抗疲勞活性，而化合物Ⅱ?yàn)榄h(huán)烯醚萜苷類化合物，此前多有研究[16]報(bào)道該化合物具有抗疲勞活性，因此對(duì)化合物Ⅱ單體進(jìn)行抗疲勞評(píng)價(jià)，其作用如表3所示。

由表3可知，單體化合物Ⅱ組小鼠的體重顯著增加(P<0.05)，跑臺(tái)測(cè)試力竭時(shí)間和負(fù)重游泳力竭時(shí)間最長(zhǎng)，分別為(111±30.44)s和(56±4.87)s，明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，由此推斷，單體化合物Ⅱ，即4-羧基-7-羥基-8-乙酸乙酯基-3,6-環(huán)戊烯環(huán)烯醚萜苷，為核桃抗疲勞的活性成分之一。

表3化合物Ⅱ?qū)π∈篌w重、跑臺(tái)測(cè)試和負(fù)重游泳的影響?
Table 3Effect of compound II on body weight,treadmill test and weight-bearing swimming of mice(n=10)

組別體重變化/g跑臺(tái)測(cè)試力竭時(shí)間/s負(fù)重游泳力竭時(shí)間/s對(duì)照組11.22±12.1978±28.2829±3.67化合物Ⅱ組18.94±14.77?111±30.44??56±4.87??

? 與空白對(duì)照組比較，* 表示P<0.05；**表示 P<0.01。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)小鼠跑臺(tái)試驗(yàn)和負(fù)重游泳試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)正丁醇組小鼠的抗疲勞能力明顯高于乙醇提取組、乙酸乙酯組和乙醇萃取組，說(shuō)明核桃粕醇提物正丁醇萃取物含有具明顯抗疲勞作用的成分。正丁醇萃取物經(jīng)MCI柱和ODS柱分離得到的3個(gè)主要化合物，經(jīng)鑒定分別為α-乙氧基半乳糖苷、4-羧基-7-羥基-8-乙酸乙酯基-3,6-環(huán)戊烯環(huán)烯醚萜苷和尿嘧啶。

本文從核桃中分離到環(huán)烯醚萜苷類成分，并經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)表明該成分具有顯著抗疲勞功效，與核桃補(bǔ)腎固精、抗疲勞作用有關(guān)。但核桃粕中是否還存在環(huán)烯醚萜苷類類似物或其他補(bǔ)腎固精、抗疲勞功效成分還仍需進(jìn)一步研究明確。