苦參堿對人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響

湯蘇陽　蔡寶仁　黃高升　艾玉峰　張琳西

湯蘇陽女，1964年生，1987年畢業(yè)于錦州醫(yī)學(xué)院醫(yī)療系，1998期部隊(duì)中、青年人才基金班畢業(yè)，醫(yī)學(xué)碩士。發(fā)表論文十余篇，參編專著一部。［摘要］目的：研究苦參堿(Matrine,簡稱Mat)對人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響。方法：將Mat以不同濃度梯度作用于體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，測MTT反應(yīng)的A0值及LDH值，用免疫組織化學(xué)檢測Mat用藥前后的細(xì)胞核內(nèi)增殖性抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表達(dá)。結(jié)果：增生性瘢痕成纖維細(xì)胞在Mat0.25～100mg/ml范圍內(nèi)呈劑量依賴性增殖抑制，但LDH值無明顯改變；PCNA的表達(dá)，在Mat作用后明顯減弱。結(jié)論：Mat在體外能明顯抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖而不引起細(xì)胞壞死性改變。

［關(guān)鍵詞］苦參堿成纖維細(xì)胞增殖

［中圖分類號］R619+.6［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］A［文章編號］1008-6455(2001)01-0006-03

THE INFLUENCE OF MATRINE ON THE GROWTH AND PROLIFERATION

OF SCAR-DERIVED FIBROBLASTS

TANG Su-yangCAI Bao-renHUANG Gao-sheng

Department of burn and plastic,205 Hospital of PLA(Jin Zhou 121001)china

［Abstract］Objective：To study the influence of Matrine on growth and proliferation of fibroblasts derived hgpertropnic scar.〖WT5"HZ〗Methods：The MTT OD value and the content of LDH was examined by biochemical analysis after Matrine was added to the monolayer culture system of scar-derived fibroblasts.The expressions of prolifrating cell nuclear antigen (PCNA)were examinedby immunochemied methed.Results：Mat at 0.10～100.mg/ml could decrease the MTT OD value in dose dependent manner amd could not increase the content of LDH significantly.The expression of PCNA in Mat groupswas highr than the control groups.Conclusion：Mat could inhibit the proliferation of derived hypertropnicscar fibroblasts rarely produce the toxicity on scar-derived fibroblasts.

［Key words］MatrineFibroblastProliferation

增生性瘢痕是創(chuàng)傷愈合的異常結(jié)局，可造成機(jī)體的形態(tài)改變和功能障礙。故研究創(chuàng)傷愈合、瘢痕形成的機(jī)制及其治療一直是困繞整形外科的難題之一^〔1〕?？鄥㈩惿飰A(Matrice 簡稱Mat)是以苦參堿為代表的、結(jié)構(gòu)相似的一類生物堿。近年來，國內(nèi)外在研究、使用苦參類生物堿的過程中發(fā)現(xiàn)其多方面的藥理活性和臨床功能，如：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)的作用，抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗纖維化疾病作用^〔2〕。苦參堿也是我科多年以來使用的瘢痕軟化膏的主要成分，其臨床使用效果明顯，能明顯抑制瘢痕的增生，且使增生性瘢痕軟化；目前無苦參堿對人增生性瘢痕作用的報(bào)道，但很可能是極具前途的治療瘢痕增生的生物堿。通過體外培養(yǎng)的瘢痕成纖維細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，觀察苦參堿對其增殖的影響，為探討苦參堿對瘢痕的治療作用提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品：由中國生物制品、藥品檢定所提供；DMEM，胰蛋白酶：由美國Gibco公司生產(chǎn)；新生牛血清：由杭州四季青生物工程材料研究所生產(chǎn)；DMSO由上海Sangen公司生產(chǎn)；MTT由美國Sigma公司生產(chǎn)。Ⅰ抗鼠抗人PCNA單克隆抗體，Ⅱ抗DokA Envision+〔TM〕購于丹麥DAKO公司，DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法手術(shù)中取增生性瘢痕組四例，年齡2～25歲，在無菌條件下經(jīng)漂洗、剪碎，培養(yǎng)于含200ml/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃，CO₂孵箱中培養(yǎng)，待長成致密單層后用2.5g/L胰蛋白酶消化，以1∶3傳代。實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞為第4～9代細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分成11組，藥物濃度單位為mg/ml，詳見附表。

1.2.1乳酸脫氫酶(LDH)的測定取對數(shù)生長期細(xì)胞，用24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔接種2.5×104個(gè)細(xì)胞，置CO₂孵箱內(nèi)培養(yǎng)7d，每3d換液1次，按分組加入條件培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)24h，取上清，用全自動(dòng)生化分析儀測定LDH活性值。

1.2.2MTT比色法測定細(xì)胞增殖狀況取對數(shù)生長期細(xì)胞，在96孔培養(yǎng)板中接種5×10³個(gè)細(xì)胞+DMEM培養(yǎng)液200μL，置CO₂孵箱內(nèi)培養(yǎng)8h，吸棄上清，按分組加入條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，加入MTT液10μL/孔振蕩顯色，自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀測定A0值。(波長490nm)增殖抑制率(%)=〔1-(實(shí)驗(yàn)組吸光值-對照組吸光值)/對照組吸光值〕×100%^〔3〕。

1.2.3PCNA檢測取對數(shù)生長期細(xì)胞，將蓋玻片置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞，于CO₂孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，分2組分別加入0.5～1.0mg/ml苦參堿條件培養(yǎng)液和空白加培養(yǎng)液組；培養(yǎng)24h后，用甲醇和丙酮固定，晾干24h后，中性樹脂粘片，PBS沖洗振蕩三次，每次5min，用1%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，甩干加Ⅰ抗，4℃過夜，復(fù)溫1h，PBS沖洗振蕩三次，每次5min。甩干加Ⅱ抗，放置37℃1h后，PBS沖洗振蕩3次，每次5min。甩干，DAB顯色。

2結(jié)果

2.1苦參堿對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)和增殖的影響ゼ尤肟嗖渭24h后，G1-G8各組中LDH值與對照組C比無顯著差異(P＞0.05)，G9-G10組與對照組C比差異顯著(P＜0.05)。ゼ尤肟嗖渭24h后，從成纖維細(xì)胞的MTT比色吸光值的結(jié)果得出，苦參堿對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞作用的增殖抑制率：在0.25～100mg/ml范圍內(nèi)成劑量依賴性抑制作用。見附表。

附表Mat不同濃度組與細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH、細(xì)胞增殖抑制率的關(guān)系

2.2PCNA檢測結(jié)果顯示，對照組增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)可見高密度棕黃色陽性信號，而經(jīng)苦參堿作用后，其成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)可見淡黃色陰性信號，PCNA表達(dá)較弱，見圖1，2(見封三彩頁圖B1、2)。

3討論

3.1多年以來，醫(yī)學(xué)界一直在尋找治療瘢痕的有效途徑。苦參堿是具有生物調(diào)節(jié)作用的生物堿，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為四環(huán)喹嗪啶類稠合體，分子量為248.37，分子式為C15H24N₂O。為證實(shí)苦參堿對瘢痕的治療作用，本文通過體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的MTT和LDH實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證苦參堿對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖呈劑量依賴性抑制作用，隨著苦參堿濃度升高，細(xì)胞呈抑制狀態(tài)，在0.5mg/ml～5.0mg/ml細(xì)胞增殖抑制率約50%；通過細(xì)胞培養(yǎng)上清中的乳酸脫氫酶的檢測，證實(shí)苦參堿在0.10mg/ml～100mg/ml對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞不產(chǎn)生毒性作用，當(dāng)濃度超過150mg/ml～200mg/ml時(shí)對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞有毒性作用，在200mg/ml濃度時(shí)可致發(fā)生細(xì)胞壞死性改變。

3.2在細(xì)胞周期中，一些蛋白質(zhì)的合成對于細(xì)胞進(jìn)入由G0/G1期進(jìn)入S期是必不可少的，如，降鈣素、非組蛋白、染色體蛋白和PCNA等，PCNA又稱周期蛋白(cyclin)，首先由Miyachi提純^〔4〕，PCNA單抗是針對增殖細(xì)胞核抗原(prolideration cell nuclear antigen)的抗體，其功能是DNA多聚酶δ的輔助因子，它的出現(xiàn)明顯與細(xì)胞增殖有關(guān)，在靜止期其量很少，G1晚期開始增加，S期達(dá)到高峰，G₂、M期明顯下降〔5，6〕。故PCNA是了解細(xì)胞增殖活性狀態(tài)的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)苦參堿作用后PCNA的表達(dá)明顯減弱，說明苦參堿可抑制呈活性增殖狀態(tài)的瘢痕成纖維細(xì)胞，使其DNA的合成明顯減少，增殖受阻。ド鮮黿峁驗(yàn)證苦參堿對瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖活性有明顯的抑制作用，其抑制機(jī)制的研究有待于進(jìn)一步深入，為利用中藥、開發(fā)治療增生性瘢痕的新途徑提供依據(jù)。

［參考文獻(xiàn)］

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收稿日期2000-10-24

編輯/樊延南