電針對大鼠腦局部缺血再灌流后c-fos、mRNA表達的影響

王　利　張學(xué)勤　張　勇　盧志達

(崇文區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,北京100061;1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院)

摘要采用Wistar大鼠,線栓法制作腦局部缺血再灌流動物模型,以原位雜交技術(shù)及蘇木素-伊紅(HE)染色方法,觀察電針對缺血側(cè)額葉、頂葉及海馬各區(qū)內(nèi)c-fos、mRNA表達并神經(jīng)元組織形態(tài)學(xué)改變的影響。結(jié)果表明,電針能顯著增強腦局部缺血再灌流后病灶側(cè)額、頂葉皮層及海馬各區(qū)c-fos、mRNA表達,并能減少缺血再灌流損傷后上述各腦區(qū)神經(jīng)元的變性壞死。結(jié)果提示電針對腦局部缺血后受損神經(jīng)元的保護作用可能與增強了c-fos、mRNA的表達有關(guān)。

主題詞電針腦缺血/針灸療法c-fos類/代謝RNA,信使/代謝再灌注損傷原癌基因蛋白質(zhì)

c-fos基因是細胞內(nèi)快反應(yīng)基因,在神經(jīng)系統(tǒng)缺血性損害時,呈一過性表達。目前,c-fos表達已被作為特定刺激下神經(jīng)元功能活動的標(biāo)志物。本實驗研究采用更接近腦卒中臨床實體的腦局部缺血再灌流動物模型,運用祖國醫(yī)學(xué)的針刺方法,結(jié)合現(xiàn)代生物學(xué)的實驗手段,旨在從分子生物學(xué)的角度為腦卒中后極早期的針刺治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物

選用健康雄性Wistar大鼠(由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供),體重200～250 g。動物麻醉采用3.5%水合氯醛,350 mg/kg腹腔注射。麻醉過程中以烤燈維持動物肛溫在36.5～37.5 ℃。

1.2動物模型制備及分組

1.2.1模型制備采用改良線栓法制作大鼠可逆性左側(cè)大腦中動脈(MCA)缺血再灌流動物模型。步驟如下:大鼠麻醉成功后,仰臥固定于手術(shù)平臺上。頸部正中開窗,分離暴露左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)及頸內(nèi)動脈(ICA)。于ECA近分叉處做一小切口,插入尼龍線至ICA內(nèi)約17 mm,結(jié)扎固定。再灌流時拔出栓子。

1.2.2動物分組實驗用大鼠隨機分為4組,即:缺血再灌流組(n=5,缺血1 h+再灌注1 h);缺血再灌流+電針組(n=5,缺血1 h+再灌流1 h+電針0.5 h);假手術(shù)組(n=3,單純分離血管);假手術(shù)+電針組(n=3,假手術(shù)+電針0.5 h)。

1.3針刺處理

1.3.1取穴依照大鼠經(jīng)穴定位法,選取"百會"、"風(fēng)府"2穴。

1.3.2刺法大鼠麻醉后,取腹臥位固定于手術(shù)平臺上。"百會"穴以毫針向前斜刺2.5 mm,"風(fēng)府"穴以毫針向后斜刺2.0 mm。針刺后以WQ-6F型電針儀給予電壓為4.5 mV,間斷頻率15次/min,f1為6 Hz,f2為8 Hz兩種頻率交替的等幅疏密波電刺激。電針于左側(cè)MCA閉塞后30 min開始,持續(xù)30 min。缺血再灌流組大鼠亦于同時相麻醉、固定,持續(xù)時間與缺血再灌流+電針組等長。

1.4c-fos、mRNA檢測

1.4.1原位雜交于實驗?zāi)┞樽韯游?經(jīng)心腔依次灌注0.9%生理鹽水及以0.01 mol/L磷酸緩沖液生理鹽水(PBS)配制的4%甲醛溶液。斷頭取腦,置于4%PBS甲醛溶液中固定48 h。將鼠腦自額極向后至枕極冠狀切為A、B、C、D、E 5個等份;依次行酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋。取C、D腦片連續(xù)切片,片厚5 μm,貼附于預(yù)先涂有光學(xué)樹脂膠(APFS)的載玻片上,用原位雜交技術(shù)進行染色。c-fos探針及鏈酶蛋白酶/辣根過氧化物酶(S-A/HRP)標(biāo)記物抗體試劑盒均購于北京中山試劑公司。具體步驟嚴格按試劑盒說明書操作。陰性對照以羊血清代替c-fos探針。

1.4.2觀察方法于C、D腦片連續(xù)切片中每隔6張取1張,共取10張;每張切片觀察10個高倍視野(OLYMPUS BH-2型光學(xué)顯微鏡,×400倍),以測微尺計數(shù)c-fos、mRNA陽性細胞。

1.5HE染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水,HE染色,光鏡下觀察。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,以分組t檢驗進行顯著性分析。數(shù)據(jù)處理采用SYSTAT軟件包。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)元c-fos、mRNA表達

c-fos、mRNA表達陽性的神經(jīng)細胞,胞核呈深棕色,胞漿不著色。假手術(shù)組與假手術(shù)+電針組在左側(cè)各腦區(qū)內(nèi)的c-fos、mRNA陽性細胞數(shù)均極少,兩組間差異無顯著性意義。與假手術(shù)組比較,缺血再灌流組與缺血再灌流+電針組左側(cè)各觀察腦區(qū)c-fos、mRNA陽性細胞數(shù)均極顯著增加。兩組均以額葉、頂葉皮層的Ⅱ～Ⅴ層神經(jīng)細胞中表達更為強烈。與缺血再灌流組比較,電針組病灶側(cè)各腦區(qū)c-fos、mRNA增加更為明顯,尤以齒狀回、額葉、頂葉皮層為著,海馬CA1、CA4區(qū)神經(jīng)細胞c-fos、mRNA陽性表達亦有顯著增加(見表1)。

2.2組織形態(tài)學(xué)改變

石蠟切片HE染色后光鏡下觀察所見:假手術(shù)組與假手術(shù)+電針組皮層及海馬各區(qū)內(nèi)神經(jīng)元形態(tài)正常。缺血再灌流組病灶側(cè)額葉、頂葉皮質(zhì)部分組織水腫,多數(shù)神經(jīng)元胞漿紅染,胞核呈不規(guī)則形固縮、深染,神經(jīng)細胞變性、壞死明顯;在海馬及齒狀回各區(qū)內(nèi)亦可見部分神經(jīng)細胞胞漿紅染,胞核固縮,細胞變性、壞死。電針組病灶側(cè)皮層僅見少量神經(jīng)細胞胞漿紅染,細胞腫脹,核固縮,但其數(shù)量明顯少于缺血再灌流組;海馬及齒狀回內(nèi)極少神經(jīng)細胞有輕度萎縮,胞漿紅染。

3討論

c-fos基因是即早基因(immediate-early genes,IEGs)家族的一員。近年來的研究表明,在正常情況下,c-fos基因參與細胞生長、繁殖分化、信號傳遞、學(xué)習(xí)與記憶等生理過程,在絕大多數(shù)細胞包括神經(jīng)元中呈極低表達;病理情況下,c-fos基因的表達及調(diào)控變化與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。c-fos基因可被一過性腦缺血所誘導(dǎo),雖然在細胞對缺血的反應(yīng)中,c-fos的作用機制尚未被完全闡明,但c-fos可以改變許多基因的表達,提示它可作為存活機制的一部分,參與針對損害的遺傳信息的產(chǎn)生。c-fos作為核內(nèi)第3信使分子,通過特殊靶基因的表達,能將細胞外短期的刺激信號轉(zhuǎn)換為長時間的細胞功能改變,從而對細胞分化和可塑性起重要作用。缺血后神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)受到破壞,特殊基因表達的改變,特別是能引導(dǎo)上調(diào)其它基因的c-fos等IEGs的表達改變,使神經(jīng)元達到特定的可塑性,以整合缺血后的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò),使被破壞的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)得以重建,恢復(fù)正常功能。腦缺血后誘導(dǎo)c-fos、mRNA表達的影響因素很多,其中之一是腦血流量。許多大鼠MCA閉塞模型實驗表明,c-fos、mRNA在缺血中心呈低表達或不表達,而在缺血半暗帶和遠離缺血區(qū)未受損的神經(jīng)細胞內(nèi)呈一過性高表達。在這兩類不同區(qū)域中,IEGs在神經(jīng)元中的表達標(biāo)志著神經(jīng)元將存活。由此說明,在缺血區(qū)內(nèi)能幸免于缺血損害的細胞存在c-fos誘導(dǎo)與表達,而一定量的局部腦血流則是產(chǎn)生表達的必要條件。

本研究采用原位雜交技術(shù)觀察了Wistar大鼠腦局部缺血1 h繼以再灌流1 h病灶側(cè)額葉、頂葉、海馬各區(qū)內(nèi)c-fos、mRNA的表達及電針對其產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明,假手術(shù)及假手術(shù)+電針組大鼠各腦區(qū)的c-fos、mRNA表達水平低下。缺血再灌流組病灶側(cè)大腦額葉、頂葉皮層的Ⅱ～Ⅴ層神經(jīng)細胞及海馬齒狀回各部位均有大量c-fos、mRNA表達,電針處理組病灶側(cè)各相應(yīng)腦區(qū)內(nèi)c-fos、mRNA的表達呈顯著性增加(見表1)。該結(jié)果與文獻報告相一致。光鏡下組織形態(tài)學(xué)觀察所見,電針處理后病灶側(cè)上述各腦區(qū)的神經(jīng)元變性壞死數(shù)目較之缺血再灌流組明顯減少,程度亦減輕,提示電針處理對缺血神經(jīng)元有良好的保護作用。由于針刺可以使缺血局部的血管阻力下降,增加腦缺血部位的血流量,從而使c-fos、mRNA的表達增加,受損神經(jīng)元得到保護,減輕了腦缺血再灌流后的神經(jīng)元損傷。影響c-fos、mRNA在腦缺血后誘導(dǎo)表達的因素還有(1)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的激活,(2)細胞內(nèi)Ca++的增多,(3)擴展性抑制等。針刺的作用是否還涉及上述方面,尚需進一步研究以證實。近年來的一些實驗研究表明,電針療法對腦缺血再灌流損傷確有保護作用,可以改善腦缺血再灌流后神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙,減輕腦水腫及缺血后神經(jīng)元損傷,促進神經(jīng)細胞功能的恢復(fù)。本研究結(jié)果提示,電針對腦局部缺血再灌流所造成的神經(jīng)元損傷具有保護作用,其作用機制可能與電針增加c-fos、mRNA表達有關(guān)。

本研究所選用的穴位"百會"及"風(fēng)府"均為督脈之穴。依據(jù)祖國醫(yī)學(xué)的理論,治療中風(fēng)選取督脈經(jīng)穴,主要在于督脈總督一身之陽脈,為"陽脈之海";督脈上行至風(fēng)府,入于腦,故和腦有密切的關(guān)系。針刺督脈可以振奮周身之陽氣,疏通經(jīng)絡(luò)、健腦補髓、醒腦開竅,從而達到治療之目的。

(收稿日期:1999-04-22,齊淑蘭發(fā)稿)