REACH法規(guī)的環(huán)境影響試驗(yàn)法

小島肇夫

REACH法規(guī)的環(huán)境影響試驗(yàn)法

小島肇夫

REACH法規(guī)是針對(duì)化學(xué)品及其安全性的一項(xiàng)新技術(shù)法規(guī)，它解決化學(xué)品的出口、評(píng)估、許可和限制事宜，為化學(xué)品提供更全面的安全性數(shù)據(jù)，旨在提高化學(xué)物質(zhì)對(duì)人類健康和環(huán)境的安全性。本文綜述了REACH關(guān)于生物毒性、降解性及環(huán)境影響的評(píng)價(jià)內(nèi)容，幫助企業(yè)加深對(duì)REACH的認(rèn)識(shí)。

REACH；環(huán)境評(píng)價(jià)；OECD試驗(yàn)指南

REACH是歐盟對(duì)在市場(chǎng)流通的現(xiàn)有化學(xué)物質(zhì)和新型化學(xué)物質(zhì)實(shí)施的一項(xiàng)法規(guī)，它要求供應(yīng)商為所提供的化學(xué)物提供有關(guān)的安全性數(shù)據(jù)，并按指定要求履行登錄的義務(wù)，是注冊(cè)、評(píng)價(jià)、許可、限制的總稱。歐盟2007年開始提出相關(guān)要求，2008年6月開始運(yùn)作，2018年6月完成年產(chǎn)量或進(jìn)口量1噸以上化學(xué)物質(zhì)的注冊(cè)工作。本來(lái)，REACH只是歐盟的內(nèi)部事務(wù)，但如今已成為全球性的安全性評(píng)價(jià)問(wèn)題，日本從不關(guān)心此事到為整個(gè)產(chǎn)業(yè)界積極采取對(duì)策，可見REACH法規(guī)對(duì)日本制造業(yè)的影響之大。

1 REACH要求的安全性資料

REACH的安全性評(píng)價(jià)包括毒理性和危險(xiǎn)性（毒性和曝露性評(píng)價(jià)）兩項(xiàng)基本內(nèi)容，2009年底進(jìn)行事前登錄的化學(xué)物質(zhì)約有18萬(wàn)個(gè)，其中70%的試驗(yàn)將在2011～2017年實(shí)施。

表1 REACH根據(jù)制造量/進(jìn)口量列出的必須實(shí)施的危險(xiǎn)性試驗(yàn)方法

表1是根據(jù)制造量和進(jìn)口量列出的必須實(shí)施的危險(xiǎn)性試驗(yàn)方法。在該試驗(yàn)法中沒(méi)有對(duì)少量生產(chǎn)物質(zhì)的有害性試驗(yàn)，對(duì)10t以上新型化學(xué)物質(zhì)的生產(chǎn)還要求進(jìn)行曝露性的評(píng)價(jià)試驗(yàn)。充分掌握表1所示試驗(yàn)法的精髓對(duì)把握試驗(yàn)結(jié)果非常重要。本文將主要討論與環(huán)境影響評(píng)價(jià)有關(guān)的試驗(yàn)法及其選擇。

REACH的環(huán)境影響評(píng)價(jià)試驗(yàn)法大致分為4類：1）對(duì)水生生物的影響；2）對(duì)活性污泥呼吸的抑制作用；3）在環(huán)境中的行為和結(jié)果；4）對(duì)陸生生物的影響。表2是化學(xué)物對(duì)水生生物的主要影響試驗(yàn)法，超過(guò)1t的新型化學(xué)物必須進(jìn)行無(wú)脊椎動(dòng)物的急性毒性試驗(yàn)和對(duì)水生物的生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)；對(duì)于超過(guò)10t的新型化學(xué)物，還必須進(jìn)行魚類的急性毒性試驗(yàn)。但是，試驗(yàn)物質(zhì)的溶解性是一項(xiàng)關(guān)鍵性指標(biāo)，對(duì)溶解性低的場(chǎng)合，除進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)外，還必須進(jìn)行長(zhǎng)期的毒性試驗(yàn)；對(duì)100t以上的化學(xué)物質(zhì)，必須進(jìn)行無(wú)脊椎動(dòng)物和魚類的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)。REACH試驗(yàn)法以選定生物群的生態(tài)機(jī)能為重點(diǎn)，從中選取感受性高的生物作為試驗(yàn)對(duì)象，并以O(shè)ECD試驗(yàn)指南的方式推薦給用戶。表2是OECD試驗(yàn)指南，表3是OECD指南收錄的主要文件。

2 環(huán)境影響評(píng)價(jià)試驗(yàn)法概要

2.1 對(duì)水生生物的影響試驗(yàn)

無(wú)脊椎動(dòng)物、藻類、魚類常用作對(duì)水生生物影響的毒性試驗(yàn)的評(píng)價(jià)對(duì)象。急性毒性試驗(yàn)以能引起無(wú)脊椎動(dòng)物、藻類、魚類死亡的濃度EC（有效作用濃度）和LC（致死濃度）為指標(biāo)，慢性毒性試驗(yàn)則以致死或成長(zhǎng)和繁殖等指標(biāo)來(lái)衡量。

表2 OECD收錄的與生態(tài)有關(guān)的試驗(yàn)指南

表3 OECD收錄的與生態(tài)有關(guān)的試驗(yàn)指南文件

2.1.1 用無(wú)脊椎動(dòng)物進(jìn)行的急性毒性試驗(yàn)

OECD試驗(yàn)指南202條推薦使用Daphnia magna（一種水蚤）作為急性游泳抑制試驗(yàn)對(duì)象，這是由于水蚤對(duì)化學(xué)物質(zhì)的感受性較高之故。把水蚤暴露于含化學(xué)物質(zhì)的水中48h后，觀察水蚤的游泳狀態(tài)（以在運(yùn)動(dòng)的容器中靜止15s為限）。測(cè)定游泳試驗(yàn)中的半數(shù)抑制濃度時(shí)，在含不同濃度化學(xué)物質(zhì)的水中放入出生時(shí)間在24h內(nèi)的水蚤幼蟲，24h和48h分別觀察水蚤幼蟲的致死量。

2.1.2 用水生生物進(jìn)行生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)

OECD試驗(yàn)指南201條推薦以藻類為生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)對(duì)象，藻類多使用小球藻等品種（藻類壽命很短，適合在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行急性和慢性毒性評(píng)價(jià)）。試驗(yàn)時(shí)，通常會(huì)考察藻類在含化學(xué)物質(zhì)的環(huán)境中曝露72h后，化學(xué)物對(duì)藻類生長(zhǎng)性的影響，在含不同濃度化學(xué)物質(zhì)的水中按指數(shù)函數(shù)的比例放入藻類，在光照條件下培養(yǎng)72h，每24h測(cè)定一次存活的藻類數(shù)，由此可得到半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度（EC50）和無(wú)影響濃度（NOEC）。

2.1.3 魚類急性毒性試驗(yàn)

OECD試驗(yàn)指南203條要求使用魚類（推薦Oryzias latipes、斑魚、鯉魚、食蚊魚、鮭魚）進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，觀察化學(xué)物對(duì)魚類生存性的影響。試驗(yàn)時(shí)，在含不同濃度化學(xué)物質(zhì)的水中放入幼魚（0.1～5g），96h后測(cè)定幼魚的死亡數(shù)，測(cè)得半致死濃度LC50。

2.1.4 無(wú)脊椎動(dòng)物的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)

OECD試驗(yàn)指南211條要求使用水蚤作繁殖抑制性試驗(yàn)，觀察水蚤在含化學(xué)物質(zhì)的水中曝露21天后對(duì)其繁殖性的影響。這種比較簡(jiǎn)便的試驗(yàn)方法常被用來(lái)進(jìn)行有害性評(píng)價(jià)試驗(yàn)。根據(jù)母水蚤的毒性癥狀和初次產(chǎn)仔日、幼蟲產(chǎn)出數(shù)、死亡數(shù)、產(chǎn)仔幼體的生存和死亡數(shù)，獲得半數(shù)繁殖抑制濃度EC50和無(wú)影響濃度NOEC。

2.1.5 魚類長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)

本試驗(yàn)分為三項(xiàng)，是REACH中必須檢測(cè)的項(xiàng)目。

1）魚類初期生活階段的毒性。OECD試驗(yàn)指南210條要求選擇有代表性的受精卵孵化，在幼魚的初期生長(zhǎng)階段使其曝露于含化學(xué)物質(zhì)的水中，期限為30天，觀察化學(xué)物質(zhì)對(duì)幼魚的慢性影響，試驗(yàn)時(shí)把Oryzias latipes、斑魚、鮭魚等魚類的受精卵放入小槽，并與對(duì)照區(qū)的魚卵對(duì)比，觀察魚卵的孵化數(shù)、生存數(shù)、體型異常、行動(dòng)阻害、體長(zhǎng)及體重變化，從而求出最低有影響濃度（LOEC）及NOEC。

2）對(duì)胚胎、幼魚的短期毒性。OECD試驗(yàn)指南第212條規(guī)定，選擇有代表性的受精卵孵化成幼魚，考察化學(xué)物質(zhì)的短期毒性。試驗(yàn)時(shí)，把Oryzias latipes、斑魚、鮭魚等的受精卵放入水槽，每種幼魚的卵黃均被取出，對(duì)照區(qū)的幼魚出現(xiàn)因饑餓死亡的現(xiàn)象時(shí)試驗(yàn)終止。測(cè)定累積死亡率、健康的幼魚數(shù)、孵化開始的天數(shù)、孵化數(shù)、成長(zhǎng)等項(xiàng)目，得出LOEC及NOEC數(shù)值。

3）幼魚成長(zhǎng)。OECD試驗(yàn)指南215條規(guī)定選取有代表性的幼魚進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)曝露試驗(yàn)。本試驗(yàn)使用鮭魚作為試驗(yàn)對(duì)象，在含化學(xué)物質(zhì)的水中曝露28天，測(cè)定鮭魚的體重、成長(zhǎng)率，從而求得LOEC與NOEC數(shù)值。

魚類是各地區(qū)最常使用的試驗(yàn)動(dòng)物。圖1是ECVAM（歐洲動(dòng)物實(shí)驗(yàn)代替法檢驗(yàn)中心）的評(píng)價(jià)程序，該機(jī)構(gòu)建議盡可能少地使用魚類進(jìn)行上述試驗(yàn)，即：第一階段，先用水蚤和藻類進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)得到的EC值再進(jìn)行第二階段試驗(yàn)；第二階段用低濃度化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行有限度的試驗(yàn)，依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出該化學(xué)物的LC值。此外，ECVAM還嘗試用魚類細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性，用魚類胚胎進(jìn)行魚的活體代替試驗(yàn)。

圖1 ECVAM推薦的環(huán)境毒性評(píng)價(jià)程序

2.2 活性污泥呼吸抑制試驗(yàn)

應(yīng)用活性污泥作基體，觀察污泥在不同濃度的化學(xué)物質(zhì)下的呼吸率（喜氧性污泥對(duì)廢水中微生物的消耗量），從而評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)對(duì)微生物的影響。試驗(yàn)中選用污水處理廠的活性污泥，測(cè)定30min和3h后的氧消耗量，確定化學(xué)物質(zhì)的半數(shù)呼吸抑制濃度（EC50）。生物分解性試驗(yàn)（OECD指南301A-F）中，以相當(dāng)于EC50的1/10的濃度考察化學(xué)物質(zhì)對(duì)活性污泥的影響，其中生物分解性試驗(yàn)中的濃度參照活性污泥呼吸抑制試驗(yàn)中的NOEC值確定。

2.3 在環(huán)境中的行為和結(jié)果

化學(xué)物質(zhì)在環(huán)境中的分解性、蓄積性等環(huán)境命運(yùn)性數(shù)據(jù)，除了化學(xué)物質(zhì)的長(zhǎng)期環(huán)境影響評(píng)價(jià)外，PBT（持續(xù)生物累積與有毒化學(xué)物質(zhì)）/vPvB（最大持久和生物累積）的評(píng)價(jià)同樣重要。加水分解試驗(yàn)是反映非生物分解的方法，化學(xué)物質(zhì)的生物分解性則可從易分解性試驗(yàn)與生物濃縮度試驗(yàn)進(jìn)行考察。

2.3.1 加水分解試驗(yàn)

為了得到化學(xué)物質(zhì)非生物分解性的相關(guān)信息，本試驗(yàn)將化學(xué)物質(zhì)在環(huán)境表層水中的殘留狀況及其影響作為判斷的依據(jù)。加水分解試驗(yàn)與pH有關(guān)，OECD指南111條規(guī)定了化學(xué)物質(zhì)在指定緩沖液（pH）下的加水分解測(cè)定方法。預(yù)備試驗(yàn)：在50℃、pH4、7、9反應(yīng)5天，如果化學(xué)物質(zhì)的分解性＜10%，則認(rèn)為該化學(xué)物質(zhì)是穩(wěn)定的；如果分解性＞10%，則在0～40℃、pH4、7、9條件下，選擇合適溫度再次進(jìn)行類似試驗(yàn)，確認(rèn)其穩(wěn)定性。

2.3.2 易分解性試驗(yàn)

OECD指南第301條規(guī)定了易分解化學(xué)物質(zhì)的篩選試驗(yàn)方法，相關(guān)試驗(yàn)包括：A）Doc Die-Awauy試驗(yàn)；B）CO2發(fā)生試驗(yàn)；C）改進(jìn)的MITI試驗(yàn)；D）閉瓶試驗(yàn)；E）改進(jìn)的OECD篩選試驗(yàn)；F）測(cè)壓呼吸試驗(yàn)。在DOC試驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)28天曝露后，如果該化學(xué)物質(zhì)的分解率＞70%，則認(rèn)為它易于降解。這是因?yàn)椋珺OD試驗(yàn)中將理論分解率最高估設(shè)為60%，超過(guò)此值則判定該化學(xué)物易于分解。

2.3.3 濃縮度試驗(yàn)

OECD指南第305條推薦用魚類考察化學(xué)物質(zhì)在生物體內(nèi)的濃縮度。在流動(dòng)水的條件下，以不少于兩種濃度（根據(jù)魚類急性毒性試驗(yàn)得到的LC50值的1/100～1/ 10000選擇2種盡可能低的濃度）曝露28天，依據(jù)測(cè)定的數(shù)值求出化學(xué)物質(zhì)在魚體內(nèi)的濃縮倍率。

2.4 對(duì)陸生生物的影響

OECD指南第218和219條規(guī)定采用搖蚊毒性試驗(yàn)，評(píng)價(jià)化學(xué)物對(duì)底層生物的影響。試驗(yàn)是在底質(zhì)中添加化學(xué)物質(zhì)后，把Chironomus Yoshimatsui（搖蚊的一種）卵化后一歲的幼蟲置于底質(zhì)中，當(dāng)幼蟲出現(xiàn)羽化時(shí)，測(cè)定化學(xué)物質(zhì)對(duì)幼蟲成長(zhǎng)及羽化率的影響。

化學(xué)物質(zhì)對(duì)鳥類的影響，則是依據(jù)OECD指南第206條規(guī)定，以適量的化學(xué)物質(zhì)投食母鳥與雛鳥，進(jìn)而考察化學(xué)物質(zhì)對(duì)鳥類繁殖性的影響。試驗(yàn)推薦選用鴨、科林鵪鶉、鵪鶉中的1種以上鳥類，根據(jù)死亡率、中毒性、母鳥雛鳥體重、攝餌量確定LOEC與NOEC值。

2.5 其他

土壤對(duì)化學(xué)物質(zhì)的吸附試驗(yàn)：對(duì)10t以上的化學(xué)物質(zhì)，依據(jù)吸附/脫附篩選試驗(yàn)（OECD指南121高速液相色譜法測(cè)定的土壤吸附系數(shù)）進(jìn)行；對(duì)100t以上的化學(xué)物質(zhì)，依據(jù)吸附/脫附追加試驗(yàn)（OECD指南106：批量反應(yīng)平衡吸附/脫附法）實(shí)施。對(duì)100t以上的化學(xué)物質(zhì)，還需進(jìn)行在表層水中的最終分解試驗(yàn)（OECD指南309）、土壤模擬試驗(yàn)（OECD指南308）和底質(zhì)模擬試驗(yàn)（OECD指南307）三項(xiàng)試驗(yàn)。

3 總結(jié)

REACH法規(guī)名義上是一項(xiàng)針對(duì)化學(xué)物質(zhì)環(huán)境安全性的規(guī)定，實(shí)際上它還是化學(xué)品的環(huán)境準(zhǔn)入門檻。日本環(huán)境省和國(guó)立環(huán)境研究所對(duì)OECD試驗(yàn)法的確立給予了大力支持，以下幾項(xiàng)試驗(yàn)是國(guó)立環(huán)境研究所對(duì)OECD試驗(yàn)法作出的貢獻(xiàn)：①21天的魚類篩選試驗(yàn)；②用水蚤為試驗(yàn)對(duì)象的試驗(yàn)方法；③用魚類培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行試管內(nèi)試驗(yàn)法匯總；④協(xié)同REACH對(duì)兩生類動(dòng)物研討。作為歐盟以外的國(guó)家，日本充分把握與自身出口產(chǎn)品相關(guān)的REACH動(dòng)向，以幫助本國(guó)企業(yè)快速應(yīng)對(duì)REACH的影響。

岳霄編譯自日本FRAGRANCE JOURNAL，2009.8