p53基因突變對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞Connexin 45蛋白表達(dá)影響

［摘要］目的探究p53基因突變對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞連接蛋白45（Connexin 45）表達(dá)的影響。方法培養(yǎng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87細(xì)胞（p53野生型）和U251細(xì)胞（p53突變型），用免疫印跡法檢測(cè)兩種細(xì)胞P53和Connexin 45蛋白的表達(dá)。結(jié)果與U87細(xì)胞相比，U251細(xì)胞中P53蛋白和Connexin 45蛋白的表達(dá)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.054、4.199，P＜0.05）。結(jié)論p53突變可能會(huì)引起膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞Connexin 45蛋白的表達(dá)降低。

［關(guān)鍵詞］基因，p53；突變；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；細(xì)胞；連接蛋白45

［中圖分類號(hào)］R394.2;R730.264

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［文章編號(hào)］2096-5532（2024）04-0475-03doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.049

［開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240424.1324.006;2024-04-2514：41：01

Effect of p53 gene mutation on the protein expression of Connexin 45 in glioblastoma cellsLIU Xinran， HUAN Xuejie， DU Xi-xun， CHEN Xi， JIAO Qian， JIANG Hong

（State Key Disciplins： Physiology （Incubation）， Department of Physiology， Qing-

dao University， Qingdao 266071， China）; ［Abstract］ObjectiveTo investigate the effect of p53 gene mutation on the protein expression of Connexin 45 in glioblastoma cells. MethodsGlioblastoma U87 cells （wild-type p53 gene） and U251 cells （mutant p53 gene） were cultured， and then Western blotting was used to measure the protein expression levels of P53 and Connexin 45.ResultsCompared widf8b2a9c11d95f0b1541da0feaaf36e3dbc39a30ecaec66b6713542138c902fcth U87 cells， U251 cells showed significant reductions in the protein expression levels of P53 and Connexin 45 （t=6.054，4.199;P<0.05）. ConclusionThe p53 gene mutation may reducethe protein expression level of Connexin 45 in glioblastoma cells.

［Key words］genes， p53; mutation; glioblastoma; cells; Connexin 45

膠質(zhì)瘤是人顱腦最常見(jiàn)且最具侵襲性的一種原發(fā)性腫瘤。近年來(lái)隨著手術(shù)、放療和化療等治療手段不斷進(jìn)步，其治療效果有所改善，但臨床研究顯示腦膠質(zhì)瘤病人確診后中位生存期仍然只有1年[1]。P53作為一種關(guān)鍵的腫瘤抑制因子，在人類腫瘤中極易發(fā)生突變。越來(lái)越多的研究證據(jù)表明，惡性腫瘤和不良預(yù)后常與突變的p53高度相關(guān)[2]。縫隙連接是一種由連接蛋白組成的特殊的蛋白質(zhì)通道，允許離子和小分子在細(xì)胞間直接轉(zhuǎn)移，為細(xì)胞間直接提供信息交換的通道[3]。研究發(fā)現(xiàn)，連接蛋白在非病理性遷移過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，可以參與癌細(xì)胞的遷移和侵襲的調(diào)控[4]。其中，連接蛋白45（Connexin 45）是一種縫隙連接蛋白，其編碼基因?qū)俚诙愐职┗?，RNA印跡顯示Connexin 45在許多細(xì)胞系中均可表達(dá)[5]。既往研究表明，Connexin 45表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)[6]。然而，關(guān)于p53突變?cè)谀z質(zhì)母細(xì)胞瘤中對(duì)Connexin 45的調(diào)節(jié)作用的研究目前尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)p53野生型U87細(xì)胞與p53突變型U251細(xì)胞Connexin 45的表達(dá)，旨在研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞p53基因突變對(duì)Connexin 45表達(dá)的影響。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞及其來(lái)源實(shí)驗(yàn)所用人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞（p53野生型）和U251細(xì)胞（p53突變型），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑DMEM高糖培養(yǎng)液（以色列BI公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），青霉素-鏈霉素混合液（100×，北京索萊寶科技有限公司），P53和Connexin 45抗體（美國(guó)Santa Cruz Biotech-nology），GAPDH抗體和羊抗兔IgG-HRP（武漢愛(ài)博泰克（ABclonal）生物科技有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將U87細(xì)胞和U251細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)復(fù)蘇后，加入高糖DMEM培養(yǎng)液（含體積分?jǐn)?shù)0.01青霉素-鏈霉素合劑和體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清）并置于二氧化碳無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，使用PBS清洗細(xì)胞加入胰蛋白酶消化后收集于15 mL離心管中，以1 000 r/min離心5 min。用吸管將上清吸除，向離心管中加入新的完全培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打成均勻的單細(xì)胞懸液，接種于新的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2.2免疫印跡法檢測(cè)P53和Connexin 45蛋白表達(dá)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87和U251細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后用PBS洗滌，加入含有10 g/L磷酸酶抑制劑和20 g/L蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液。冰上充分裂解20 min，提取總蛋白，蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。上樣后首先進(jìn)行恒電壓80 V電泳30 min，然后采用120 V電壓電泳1 h，恒電流300 mA轉(zhuǎn)膜90 min。將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，以100 g/L的脫脂奶粉室溫封閉90 min。根據(jù)所需的目的蛋白分子量對(duì)PVDF膜進(jìn)行剪裁，加入GAPDH（1∶10 000）、P53和Connexin 45（1∶1 000）一抗于4 ℃搖床過(guò)夜。次日，孵育完成后，用TBST搖洗3次，每次10 min。加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）耦聯(lián)的山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h。最后加入ECL超敏發(fā)光液（將其試劑盒中的A液與B液1∶1混合）孵育30 s，采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描密度測(cè)定法進(jìn)行分析。使用Image J軟件分析GAPDH以及P53、Connexin 45的條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Prism Graph Pad 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，兩組均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1U87與U251細(xì)胞P53蛋白表達(dá)比較

免疫印跡檢測(cè)的結(jié)果顯示，P53蛋白在U87和U251細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量分別為1.067±0.115和0.301±0.053（n=6）。與U87細(xì)胞相比較，P53蛋白在U251細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.054，P＜0.001）。見(jiàn)圖1。

2.2U87與U251細(xì)胞Connexin 45蛋白表達(dá)比較

免疫印跡檢測(cè)結(jié)果表明，Connexin 45蛋白在U87和U251細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量分別為0.842±0.079和0.405±0.068（n=6）。與U87細(xì)胞相比較，Connexin 45蛋白在U251細(xì)胞的表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.199，P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

3討論

成年人中最常見(jiàn)的惡性原發(fā)性顱腦腫瘤為膠質(zhì)瘤。其中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最易復(fù)發(fā)的惡性實(shí)體腫瘤之一，約占所有膠質(zhì)瘤的57%，約占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的48%，且病人中位生存期不足2年[7]。P53是一種腫瘤抑制因子，在應(yīng)激時(shí)被激活，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡來(lái)阻止受損細(xì)胞的增殖和維持基因組的穩(wěn)定性。P53通路的變化被認(rèn)為是導(dǎo)致低級(jí)別膠質(zhì)瘤發(fā)展為高級(jí)別膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵因素，在繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中觀察到p53的突變顯著增加[8]。p53基因突變與許多癌癥有關(guān)，在腫瘤細(xì)胞中，p53基因的突變最常發(fā)生在其DNA結(jié)合域的第102～292位氨基酸殘基之間，其中約10%為功能喪失突變，造成P53蛋白的功能喪失及改變[9]。U251細(xì)胞存在p53基因的錯(cuò)義點(diǎn)突變，其突變位點(diǎn)為R273H，造成P53蛋白含量明顯降低[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，p53突變的細(xì)胞可以誘導(dǎo)致癌小分子RNA的表達(dá)，引起高爾基體的囊泡形成，增強(qiáng)囊泡的運(yùn)輸和分泌，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[11]。此外，p53突變可以增強(qiáng)癌細(xì)胞的Warburg效應(yīng)，增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖能力[12]。

縫隙連接具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化，維持組織穩(wěn)態(tài)的生理功能。連接蛋白在腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。研究已發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，通過(guò)改變連接蛋白的表達(dá)，顯著增強(qiáng)了膠質(zhì)瘤

細(xì)胞的侵襲性[13]。有研究表明，Connexin 45在原發(fā)性結(jié)直腸癌組織高度甲基化，而在正常結(jié)直腸黏膜中則未甲基化，這表明Connexin 45表達(dá)的降低或缺失可能發(fā)生在腫瘤早期階段，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。研究顯示，在高葡萄糖刺激下，Conne-

xin 45可顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[15]。此外，有研究顯示連接蛋白表達(dá)的下調(diào)可通過(guò)P53依賴的途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移[16]。既往研究發(fā)現(xiàn)，U251細(xì)胞比U87細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力[17]。還有研究顯示，在胰腺癌細(xì)胞中，突變的P53蛋白通過(guò)與P62蛋白相互作用，加速細(xì)胞連接蛋白的降解，從而增加癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的概率[18]。此外，在非小細(xì)胞肺癌中，低氧激活MDM2-P53通路，刺激連接蛋白泛素化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移[19]。因此，我們猜測(cè)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，P53通過(guò)改變Connexin 45的表達(dá)可能會(huì)成為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲過(guò)程中一個(gè)至關(guān)重要的因素。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，U251細(xì)胞中Connexin 45的表達(dá)水平顯著低于U87細(xì)胞，表明膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中Connexin 45蛋白的表達(dá)降低可能與p53突變有關(guān)。因此，闡明突變的p53對(duì)Connexin 45表達(dá)的調(diào)節(jié)作用以及促進(jìn)膠質(zhì)瘤發(fā)展的機(jī)制，對(duì)靶向膠質(zhì)瘤提供新的治療思路具有重要意義。

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（本文編輯于國(guó)藝）