骨鈣素通過抑制脂肪組織炎癥改善肥胖小鼠胰島素敏感性

李小成， 史 麗， 任衛(wèi)東， 朱曉波

(1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 張家口 075061; 2張北縣醫(yī)院內(nèi)科，河北 張家口 076450; 3河北北方學(xué)院生物化學(xué)教研室，河北 張家口 075000)

骨鈣素通過抑制脂肪組織炎癥改善肥胖小鼠胰島素敏感性

李小成1,2， 史 麗1， 任衛(wèi)東1， 朱曉波3△

(1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 張家口 075061;2張北縣醫(yī)院內(nèi)科，河北 張家口 076450;3河北北方學(xué)院生物化學(xué)教研室，河北 張家口 075000)

目的： 為探討骨鈣素改善肥胖相關(guān)胰島素抵抗的機(jī)制，我們觀察了骨鈣素對飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織中炎癥的影響。方法: C57BL/6小鼠以高脂飲食喂養(yǎng)12周后，對肥胖小鼠每日腹腔注射骨鈣素(30 ng/kg或3 ng/kg)，對照組以等體積的生理鹽水處理。測定各組小鼠體重、體脂、血清甘油三酯和血清游離脂肪酸的變化；進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐量試驗(yàn)；免疫組化染色觀察巨噬細(xì)胞向脂肪組織的浸潤程度及巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68的蛋白表達(dá)量；實(shí)時熒光定量PCR檢測單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)及CD68的mRNA表達(dá)。結(jié)果: 骨鈣素(30 ng/kg或者3 ng/kg)處理4周，能降低HFD小鼠的體重、體脂量、空腹胰島素水平，改善其糖耐量異常和胰島素抵抗。此外，在骨鈣素(30 ng/kg)治療肥胖小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞的浸潤減少，脂肪組織中MCP-1與CD68 mRNA表達(dá)明顯降低。 結(jié)論: 骨鈣素(30 ng/kg)通過下調(diào)CD68和MCP-1表達(dá)，抑制肥胖小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞聚集及MCP-1分泌，降低小鼠體重和體內(nèi)脂肪含量，改善了肥胖小鼠的胰島素敏感性。

骨鈣素； 肥胖； 胰島素抵抗； 巨噬細(xì)胞

肥胖被認(rèn)為是一個慢性炎癥性疾病，高脂飲食后數(shù)天內(nèi)許多炎性因子開始增加[1]。在這些炎性因子中，單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)被認(rèn)為是十分重要的因子，它能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向脂肪組織的浸潤[2]，是引起脂肪組織炎癥的重要因素[3-4]。脂肪細(xì)胞與巨噬細(xì)胞間的相互作用最終引起脂肪組織的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致胰島素抵抗及Ⅱ型糖尿病的發(fā)生[5-6]。此外，近期的研究表明，肥胖狀態(tài)下MCP-1還能降低肝臟及肌肉組織絲/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)的磷酸化，直接影響胰島素的信號傳導(dǎo)，被認(rèn)為是 2 型糖尿病發(fā)生的獨(dú)立危險因素[7]。因此，減少脂肪組織中巨噬細(xì)胞的數(shù)量及MCP-1的表達(dá)水平，將有望成為肥胖相關(guān)疾病的一個新的治療靶點(diǎn)。

骨鈣素(osteocalcin)是由成骨細(xì)胞特異性合成的蛋白，早期的研究發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)骨合成及骨轉(zhuǎn)化，近年的研究表明骨鈣素在調(diào)節(jié)糖代謝及能量代謝方面也發(fā)揮了重要的作用[8-10]。骨鈣素基因敲除小鼠表現(xiàn)為胰島β細(xì)胞的減少，糖耐量的異常及胰島素抵抗[11]，而間斷或者持續(xù)給予骨鈣素治療后，不僅促進(jìn)了胰島素的分泌，改善了胰島素的敏感性，而且降低了體內(nèi)甘油三酯的水平，減輕了體重[12-13]。臨床研究中也表明，骨鈣素能使非酒精性脂肪肝患者肝臟組織Akt的磷酸化作用加強(qiáng)，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕肝臟組織炎癥反應(yīng)[14]。骨鈣素能否減少脂肪組織中巨噬細(xì)胞趨化因子的表達(dá)，如MCP-1等，從而減輕肥胖相關(guān)的慢性炎癥反應(yīng)及胰島素抵抗，國內(nèi)外尚未見相關(guān)的研究報道，為此，本文探討了骨鈣素對肥胖小鼠脂肪組織MCP-1及巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68的影響。

材 料 和 方 法

1 動物

雄性C57BL/6小鼠60只，體重20～22 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供,在室溫(22±2)℃、濕度50%～55%、12 h/12h光照變化條件下自由進(jìn)水、進(jìn)食飼養(yǎng)。

2 主要藥品和試劑

骨鈣素購自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司；TRIzol試劑購自TaKaRa; RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；甘油三酯(triglyceride，TG)、游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)、TNF-α、IL-6及胰島素ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所;抗 MCP-1 及抗 CD68 抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；DAB顯色劑購自北京中衫金橋。

3 方法

3.1 動物造模及分組 健康雄性C57BL/6小鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周后，隨機(jī)數(shù)字表選取 10只作為標(biāo)準(zhǔn)飲食(normal diet, ND)組，用普通飼料喂養(yǎng)；其余小鼠用45%高脂飼料(購自北京華阜康生物科技有限公司)喂養(yǎng)12周，篩選體重指數(shù)超過正常小鼠20%的小鼠作為肥胖模型小鼠(參照Kanda等[15]和Kamei等[16]的方法)。

將肥胖小鼠隨機(jī)分為高脂飲食(high-fat diet, HFD)組、高劑量(high dose, H)骨鈣素(30 ng/kg)處理的HFD組(HFD+ H組)和低劑量(low dose, L)骨鈣素(3 ng/kg)處理的HFD組(HFD+L組)。骨鈣素處理組每日腹腔注射骨鈣素，HFD組注射生理鹽水，共4 周，每周檢測小鼠的體重及空腹血糖。處理過程中ND組繼續(xù)普食喂養(yǎng)，肥胖小鼠繼續(xù)以高脂飲食喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，斷頭取血，靜置 30 min，離心(1 088×g、5 min)制備血清，迅速分離小鼠附睪及腎周圍脂肪組織并稱取其重量，樣品儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

3.2 血清甘油三酯、胰島素和炎性因子的檢測 甘油三酯以甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶法試劑盒測定；血清胰島素的含量以 ELISA 檢測試劑盒進(jìn)行檢測，按說明書操作，將標(biāo)準(zhǔn)品及各組血清加至包被孔37 ℃孵育2 h；各孔加入酶標(biāo)抗體37 ℃孵育1 h ；加入生物素抗體37 ℃孵育1 h ；加底物顯色液37 ℃孵育20 min；終止液終止反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀在450 nm 處測定各孔吸光度值。

3.3 胰島素耐受試驗(yàn)(insulin tolerance test，ITT) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(共16周)，小鼠禁食過夜，以1.5 IU/kg 劑量的胰島素腹腔注射，鼠尾獲得小鼠血樣，血糖儀(Roche)分別測量注射前及注射后 15、30、45、60、90和120 min 小鼠血糖濃度。

3.4 腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn) (intraperitoneal glucose tolerance test, IGTT) 實(shí)驗(yàn)小鼠空腹8 h后，分別以50%葡萄糖按2.0 g/kg 劑量給小鼠腹腔注射，鼠尾獲得血樣, 以血糖儀(Roche)分別測定注射前及注射后15、30、60和120 min時點(diǎn)血糖濃度。

3.5 免疫組織化學(xué)法染色脂肪組織中的巨噬細(xì)胞 將附睪脂肪組織取出后置于4% 多聚甲醛固定 24 h，乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，將標(biāo)本切成 4 mm 厚切片，切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水化，0.3% H2O2處理后進(jìn)行脂肪細(xì)胞免疫組織化學(xué)法雙染色。加入 1∶100 稀釋的生物素化CD68抗體，37 ℃孵育 30 min，加入 1∶100 稀釋鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)，37 ℃孵育 30 min，加入 1∶200 稀釋的兔抗CD68抗體4 ℃過夜，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，PBS清洗3 min×3 次，DAB 顯色，水溶性封片膠封片，用Nikon Eclipse Ti 顯微鏡系統(tǒng)拍照。

3.6 Real-time PCR 檢測脂肪組織CD68及MCP-1的mRNA 表達(dá) 將超低溫凍結(jié)的小鼠睪丸周圍脂肪組織稱量后用液氮預(yù)冷的研缽研磨，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測量RNA的濃度及A260/A280值。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將10 μL 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系于37 ℃ 45 min，85 ℃ 5 s 終止反應(yīng)，制備cDNA。用real-time PCR法檢測CD68及MCP-1的mRNA 表達(dá)水平。用Primer -Express 3.0軟件設(shè)計引物，MCP-1的上游引物序列為5’-CTTCCTCCACCACCATGCA-3’,下游引物序列為5’-AGCCGGCAACTGTGAACAG-3’；CD68的上游引物序列為5’-TCCTTCACGGAGACACCT-3’，下游引物序列為5-GGCTGGGAACCATTAGTC-3’； 內(nèi)參照基因β-actin的上游引物序列為5’-GGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物序列為5’-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3’；引物由上海寶生物公司合成。Real-time PCR 反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min； 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 95 ℃ 10 s, 擴(kuò)增39個循環(huán)； 65 ℃～95 ℃，每 0.5 ℃ 5 s梯度遞增。采用熒光定量PCR分析軟件Bio-Rad CFX Manager分析結(jié)果。按照公式2-ΔΔCt計算mRNA相對表達(dá)量。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間多重比較在方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行單因素方差分析，并用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行各組均數(shù)間的兩兩比較，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 骨鈣素降低肥胖小鼠脂肪含量及體重

骨鈣素4周治療，顯著降低了肥胖小鼠體重，且大劑量骨鈣素治療(30 ng/kg) 體重下降更明顯，但2個劑量組間肥胖小鼠體重?zé)o顯著差異。骨鈣素治療的2組小鼠內(nèi)臟脂肪百分比以及血清TG、FFA水平也顯著降低(P<0.05), 30 ng/kg與3 ng/kg劑量的骨鈣素對以上各參數(shù)的影響差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖1。

Figure 1.The effects of osteocalcin on body weight (A), body fat mass (B), serum triglycerides (C) and serum free fatty acid (D) in various groups. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsHFD group.

圖1 骨鈣素對各組小鼠體重、體脂及血清甘油三酯和游離脂肪酸的影響

2 骨鈣素對肥胖小鼠葡萄糖耐量的影響

腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)結(jié)果顯示，HFD肥胖小鼠IGTT曲線下面積與ND組小鼠相比顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，提示明顯的糖耐量異常。2個濃度的骨鈣素治療后肥胖小鼠IGTT曲線下面積相比于HFD小鼠顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。但2個劑量骨鈣素治療組小鼠IGTT曲線下面積相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖2。

Figure 2.The effect of osteocalcin on intraperitoneal glucose to-lerance test in various groups. Mean±SD.n=10.

圖2 骨鈣素對各組肥胖小鼠葡萄糖耐量的影響

3 骨鈣素能改善肥胖小鼠胰島素抵抗

胰島素耐量試驗(yàn)顯示，HFD肥胖小鼠的ITT曲線下面積及空腹胰島素水平升高，提示顯著的胰島素抵抗。經(jīng)過4周骨鈣素治療后的小鼠ITT曲線下面積及空腹胰島素水平顯著下降(P<0.05)，胰島素敏感性增加。2個劑量骨鈣素作用的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3。

Figure 3.The effect of osteocalcin on insulin resistance in va-rious groups. A: insulin tolerance test; B: serum insulin levels. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsHFD group.

圖3 骨鈣素對各組小鼠胰島素抵抗的影響

4 骨鈣素降低了HFD肥胖小鼠脂肪組織中炎性細(xì)胞的集聚

利用小鼠單克隆抗體CD68免疫組織化學(xué)染色分析小鼠脂肪組織中巨噬細(xì)胞的分布情況。相對于HFD組小鼠，HFD+H和ND組小鼠脂肪組織中巨噬細(xì)胞冠狀區(qū)域顯著減少。同時，巨噬細(xì)胞陽性面積統(tǒng)計結(jié)果也顯示，HFD+H組和ND組小鼠的巨噬細(xì)胞陽性面積比HFD組顯著降低(P<0.01)，但是HFD+L組巨噬細(xì)胞陽性面積較HFD組沒有明顯變化，見圖4。

Figure 4.The effect of osteocalcin on macrophage infiltration in the adipose tissue of mice in various groups (×400). Arrows indicate coronary area of CD68-positive macrophages. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsHFD group.

圖4 骨鈣素對各組小鼠脂肪組織中巨噬細(xì)胞聚集的影響

5 骨鈣素對脂肪組織中MCP-1及CD68 mRNA水平的影響

對脂肪組織中MCP-1及CD68的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行real-time PCR分析，結(jié)果顯示，HFD組CD68及MCP-1的mRNA表達(dá)較ND組顯著增加，其相對表達(dá)量分別是ND組的4.1及2.8倍(P<0.05)；HFD+H組較HFD組CD68及MCP-1的mRNA相對表達(dá)量分別減少了52%及36% (P<0.05)，HFD+L組與HFD組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖5。

Figure 5.The effect of osteocalcin on the mRNA expression of MCP-1 (A) and CD68 (B) in the adipose tissue of mice in various groups. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsHFD group.

圖5 骨鈣素對各組小鼠脂肪組織中MCP-1及CD68 mRNA表達(dá)的影響

討 論

近年，許多研究表明了肥胖與骨代謝相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系。骨鈣素作為骨代謝的一個重要調(diào)節(jié)成分，不僅參與骨合成和轉(zhuǎn)化，也在糖、脂代謝發(fā)揮重要作用，與肥胖及肥胖相關(guān)疾病密切相關(guān)。骨鈣素敲除基因小鼠出現(xiàn)葡萄糖耐受、高血糖及肥胖。骨鈣素治療的高脂飲食小鼠體重、脂肪含量及胰島素抵抗均得到了顯著改善[17]。本研究中，我們應(yīng)用骨鈣素治療(4 周)高脂喂養(yǎng)的C57小鼠也得到了同樣的結(jié)果。2個劑量的骨鈣素(30 ng/kg和3 ng/kg)均顯著降低了HFD小鼠體重、內(nèi)臟脂肪含量及血清中FFA、TG水平，也改善了HFD肥胖小鼠的葡萄糖耐量異常和胰島素抵抗。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，骨鈣素的不同作用存在著濃度依賴性， pmol 劑量的骨鈣素可有效調(diào)節(jié)胰腺β-細(xì)胞中胰島素和細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，而nmol級才能增加脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素的表達(dá)[18]。在本研究中，雖然2個劑量的骨鈣素相差9倍，但所觀察的作用沒有顯著差異。

諸多研究已經(jīng)肯定肥胖及脂肪組織的胰島素抵抗均與機(jī)體的慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)[19-21]。最早發(fā)現(xiàn)的肥胖個體脂肪組織中高水平表達(dá)的炎性因子是TNF-α[22-23]，同時也證實(shí)了它與肥胖及胰島素抵抗的密切聯(lián)系[21]。隨后，越來越多的肥胖相關(guān)的炎性因子被發(fā)現(xiàn)，如IL-6、IL-8、MCP-1等。在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖過程中，脂肪組織存在一系列的炎性因子，如IL-6、TNF-α、MCP-1等，其中MCP-1作用最為重要[15]。MCP-1是趨化因子家族成員之一，能吸引巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞向炎癥部位的聚集，巨噬細(xì)胞是炎性因子的重要來源[6]。以小鼠為模型的動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，骨髓來源的單核細(xì)胞通過血液的傳送而定居在脂肪組織中，而這些巨噬細(xì)胞導(dǎo)致了脂肪組織中TNF-α及IL-6等炎性因子的增多[5]。研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)MCP-1的轉(zhuǎn)基因小鼠，脂肪組織中出現(xiàn)了巨噬細(xì)胞集聚的增多 同時伴有胰島素抵抗。

我們通過對巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68的分析也觀察到了肥胖狀態(tài)下巨噬細(xì)胞在脂肪組織的聚集，MCP-1 mRNA表達(dá)水平增加，不同于以往研究的是，我們的研究觀察到了骨鈣素(30 ng/kg)治療可以導(dǎo)致脂肪組織中CD68及MCP-1的mRNA表達(dá)水平下降，浸潤到脂肪組織的巨噬細(xì)胞明顯減少。但是，低劑量骨鈣素(3 ng/kg)雖然降低了HFD小鼠體重、改善了HFD小鼠葡萄糖耐量異常和胰島素抵抗， 但是，卻沒有顯著減少巨噬細(xì)胞在脂肪組織的聚集及CD68和MCP-1的表達(dá)。導(dǎo)致這種差異的機(jī)制不清，或許低劑量骨鈣素的作用涉及另外的作用機(jī)制。

骨鈣素影響CD68及MCP-1表達(dá)的機(jī)制仍不清楚。尚未有骨鈣素直接作用于巨噬細(xì)胞的報道。相關(guān)的研究顯示骨鈣素可以促進(jìn)脂聯(lián)素分泌[24]、提高胰高血糖素樣肽1表達(dá)[25]，脂聯(lián)素可以刺激抗炎細(xì)胞因子的釋放，下調(diào)人巨噬細(xì)胞中前炎性因子干擾素γ的產(chǎn)生[26]；胰高血糖素樣肽-1可以阻止炎性因子對肝細(xì)胞的毒性作用[27]。本研究中，骨鈣素是否通過脂聯(lián)素和/或高血糖素樣肽-1影響巨噬細(xì)胞在脂肪組織的聚集有待進(jìn)一步研究。

骨鈣素與胰島素抵抗關(guān)系密切，對骨鈣素與脂肪組織炎性因子的研究將有助于改善胰島素抵抗的嚴(yán)重程度，為胰島素抵抗綜合征的治療研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

綜上所述，骨鈣素通過抑制肥胖小鼠脂肪組織相關(guān)的炎癥反應(yīng)，主要是巨噬細(xì)胞的聚集及其分泌的炎性因子如MCP-1，減輕了肥胖相關(guān)的體重增加，體內(nèi)脂肪含量，明顯改善了肥胖小鼠的胰島素敏感性。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Improvement of insulin sensitivity by osteocalcin inhibits inflammation in the adipose tissue of obese mice

LI Xiao-cheng1，2, SHI Li1, REN Wei-dong1, ZHU Xiao-bo3

(1DepartmentofEndocrinology,TheFirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075061,China;2DepartmentofInternalMedicine,ZhangbeiHospital,Zhangjiakou076450,China;3DepartmentofBiochemistry,HebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075000,China.E-mail:zjkzxb@163.com)

AIM: To explore the improving effect of osteocalcin on obesity-related insulin resistance and inflammation in the adipose tissue of obese mice. METHODS: The C57BL/6 mice were fed with high-fat diet for 12 weeks to obtain obese mice. Osteocalcin (30 ng/kg or 3 ng/kg) and saline solution (control) were intraperitoneally injected for other 4 weeks. The fat mass, body weight, serum triglycerides and serum free fatty acid were analyzed. Intraperitoneal glucose tolerance test and insulin tolerance test were carried out. Macrophage infiltration degree in the adipose tissue was observed by immunohistochemical staining. The mRNA expression of monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) and CD68 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. RESULTS: Osteocalcin (30 ng/kg or 3 ng/kg) treatment for 4 weeks significantly reduced the body weight, fat mass and insulin level, and improved abnormal glucose tolerance and insulin resistance in the obese mice. Moreover, the macrophage infiltration decreased, and the mRNA expression of MCP-1 and CD68 was down-regulated in the adipose tissue of obese mice treated with osteocalcin at 30 ng/kg. CONCLUSION: Osteocalcin at 30 ng/kg significantly reduces body weight and fat mass, and attenuates the severity of insulin resistance through down-regulating the mRNA expression of MCP-1 and CD68 and inbihiting macrophage infiltration in the adipose tissue of obese mice induced by high-fat diet.

Osteocalcin; Obesity; Insulin resistance; Macrophages

1000- 4718(2017)02- 0302- 06

2016- 08- 01

2016- 11- 14

R587.1； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.018

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